本文關鍵詞：Hsf4對溶酶體活性的調控，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景眼晶狀體蛋白變性形成非透明樣斑塊組織,致使光線不能投射到視網(wǎng)膜形成圖像,這一眼部疾病稱為白內障。白內障發(fā)病率達到60%-80%,是導致失明的主要原因,將近50%的失明是由白內障引起的。正常情況下,人眼中的晶狀體組織是透明的,光線能夠透過它到達視網(wǎng)膜,使人們清晰地看到物體。晶狀體由兩種細胞組成,前囊立方上皮細胞和纖維細胞。赤道區(qū)前囊上皮細胞具有無限增生的能力,并且能持續(xù)向纖維細胞分化,因此可知晶狀體是一個終生生長的器官。纖維細胞分為前囊上皮下的皮質纖維細胞和核心區(qū)的終末分化纖維細胞,終末分化的纖維細胞能合成大量折疊有序的晶狀體蛋白,并且主動失去細胞內的膜性亞細胞器(包括細胞核、內質網(wǎng)、線粒體、高爾基體等),形成能折射光線的中心透明區(qū)(也稱OFZ,organelle free zone),但纖維細胞終末分化的去膜性亞細胞器的機理還不清楚。有報道發(fā)現(xiàn)溶酶體介導的自噬和泛素-蛋白酶體是調控去亞細胞器的主要通路,溶酶體腔內的DNaseⅡbeta和水解酶參與晶狀體纖維細胞核和膜性亞細胞器的降解,基因敲除DNaseⅡbeta的小鼠晶狀體纖維細胞脫核障礙,形成非透明的白內障。然而,在終末纖維細胞分化過程中,調控溶酶體活性的信號通路仍不清楚。熱休克轉錄因子4是熱休克轉錄因子家族成員之一,該家族轉錄因子能感受外界和細胞內源性應激刺激,上調熱休克蛋白家族成員的表達,后者通過對變性蛋白的復性、分割和降解,達到對細胞生命的保護,這一過程成為熱休克應激反應。熱休克轉錄因子4主要表達在晶狀體、脾、心臟和腦組織中。Hsf4基因突變與家族顯性遺傳性白內障的發(fā)生密切相關,基因敲除Hsf4的小鼠發(fā)生先天性白內障,主要表現(xiàn)為出生后小鼠晶狀體纖維細胞分化障礙,終末分化纖維細胞脫核延遲。Hsf4主要表達在晶狀體上皮細胞和纖維細胞的核內。有報道發(fā)現(xiàn)Hsf4參與調控DNaseⅡbeta的基因表達。因此我們推論Hsf4通過調控纖維細胞溶酶體活性繼而參與終末分化纖維細胞的脫核作用。本課題將設計一系列實驗驗證Hsf4參與調控纖維細胞溶酶體活性的分子機制。目的應用小鼠晶狀體上皮細胞系mlec-Hsf4b-/-、mlec-HA-Hsf4b研究Hsf4調控溶酶體活性的分子機制。方法1.收集mlec-Hsf4b-/-、mlec-HA-Hsf4b細胞,用Western-blot檢測細胞內LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ的比例;應用免疫熒光觀察LC3自噬活化顆粒的數(shù)量,揭示Hsf4對自噬通路的調控作用。2.應用表達GFP-LC3質粒,分別轉染mlec-Hsf4b-/-、mlec-HA-Hsf4b細胞,用雷帕霉素Rapamycin和氯喹Chloroquine分別處理細胞,Rapamycin激活細胞內的自噬,Chloroquine則抑制溶酶體對自噬小體的降解,應用Western-blot檢測GFP-LC3分子中GFP的降解速度,觀察Hsf4對溶酶體活性的檢測;3.不同濃度Chloroquine處理轉染GFP-LC3的mlec-Hsf4b-/-、mlec-HA-Hsf4b,Western-blot觀察游離GFP的變化;4.用Western-blot、免疫熒光檢測溶酶體相關膜蛋白LAMP1、LAMP2(溶酶體標記物)在mlec-Hsf4b-/-、mlec-HA-Hsf4b的表達和定位,測定Hsf4對溶酶體數(shù)量和活性的調控;5.用Magic Red染色,免疫熒光檢測溶酶體內Cathepsin B的活性,從而檢測mlec-Hsf4b-/-、mlec-HA-Hsf4b內溶酶體Cathepsin B的活性是否受Hsf4b調控;6.免疫共沉淀CO-IP檢測alpha B-crystallin是否與ATP6VIA有相互作用,驗證Hsf4b是否通過其下游蛋白影響溶酶體活性。結果1.過表達Hsf4b導致細胞內自噬反應增強;2.Rapamycin短時間處理,晶狀體上皮細胞自噬增強。處理時間延長后,mlec-HA-Hsf4b的LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ明顯降低,可能由于Hsf4b促進溶酶體活性將更多的LC3-Ⅱ降解;3.Hsf4b能增加GFP-LC3分子中GFP在溶酶體中的降解。晶狀體上皮細胞經雷帕霉素(Rapamycin)處理后,細胞內溶酶體活性整體升高;4.不同濃度氯喹(Chloroquine)處理兩種晶狀體上皮細胞,可明顯的增加GFP-LC3在mlec-HA-Hsf4b細胞內的堆積,說明Hsf4b能提高溶酶體對GFP分子的降解速度;5.Magic Red染色發(fā)現(xiàn)Hsf4b能增加Cathepsin B的蛋白酶水解活性,直接說明Hsf4b增強溶酶體活性;6.通過Western-blot檢測溶酶體相關膜蛋白LAMP1、LAMP2在晶狀體上皮細胞的表達發(fā)現(xiàn),Hsf4b不影響溶酶體的數(shù)量,但通過免疫熒光發(fā)現(xiàn)Hsf4b影響溶酶體的定位方式。LAMP1以聚積狀態(tài)分布于在mlec-Hsf4b-/-核周,而均勻分布于mlec-HA-Hsf4b核周;LAMP2在mlec-Hsf4b-/-核周均勻分布,而在mlec-HA-Hsf4b細胞質和核內都存在;7.CO-IP檢測暫未發(fā)現(xiàn)Hsf4b下游基因cryαb與ATP6VIA有相互作用,仍需進一步確定。結論1.Hsf4促進細胞自噬的發(fā)生;2.Hsf4參與上調晶狀體上皮細胞內溶酶體的生物活性。
【關鍵詞】：Hsf4 自噬 溶酶體活性 晶狀體發(fā)育 白內障
【學位授予單位】：河南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R776.1
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-12
• 縮略詞表12-13
• 引言13-17
• 1 材料、儀器17-23
• 1.1 主要材料與試劑17-23
• 1.1.1 細胞株、細菌以及質粒來源17
• 1.1.2 主要試劑17-18
• 1.1.3 主要試劑的配制18-21
• 1.1.4 主要儀器21-23
• 2 實驗方法23-31
• 2.1 質粒的轉化與轉染23-24
• 2.1.1 質粒的轉化23
• 2.1.2 質粒轉染細胞23-24
• 2.2 細胞培養(yǎng)24-25
• 2.2.1 細胞復蘇24
• 2.2.2 細胞傳代24
• 2.2.3 細胞計數(shù)24-25
• 2.2.4 細胞凍存25
• 2.3 Western Blot25-28
• 2.3.1 提取細胞蛋白25
• 2.3.2 測蛋白濃度25-26
• 2.3.3 蛋白質凝膠電泳26-28
• 2.4 提取細胞RNA28-29
• 2.5 免疫熒光29
• 2.6 免疫共沉淀29-31
• 3 實驗結果31-41
• 3.1 Hsf4增強自噬的發(fā)生31-32
• 3.2 Hsf4促進雷帕霉素（Rapamycin）誘導的LC3-Ⅱ的降解32-33
• 3.3 Hsf4增強溶酶體介導的游離GFP的降解33-34
• 3.4 氯喹（Chloroquine）影響Hsf4介導的溶酶體活性34-36
• 3.5 Hsf4增強溶酶體活性36-37
• 3.6 Hsf4不影響溶酶體數(shù)量37-39
• 3.7 檢驗alpha B-crystallin是否與ATP6VIA相互作用39-41
• 4 討論41-45
• 結論45-47
• 參考文獻47-49
• 綜述49-61
• 參考文獻58-61
• 致謝61-63
• 在校期間獲得的獎勵和科研成果63-64

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