本文關(guān)鍵詞：人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞分化的初步實驗研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：組織工程角膜是近來興起的一項非常有前景的治療手段，其可克服供體角膜的缺乏和可能發(fā)生的免疫排斥反應(yīng)等由傳統(tǒng)角膜移植術(shù)所帶來的局限。組織工程角膜構(gòu)建最突出的問題是種子細(xì)胞的來源。由于目前大量體外培養(yǎng)獲取人的角膜內(nèi)皮細(xì)胞仍面臨著許多困難。因此，尚需進(jìn)一步尋找其他種類的細(xì)胞作為內(nèi)皮細(xì)胞的替代細(xì)胞。 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞因獲取方便、無創(chuàng)及避免了胚胎干細(xì)胞倫理學(xué)爭議等優(yōu)點，近年來被廣泛的應(yīng)用于臨床研究。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞可分化為多種間葉組織細(xì)胞，其同時在組織和細(xì)胞替代治療及再生醫(yī)學(xué)方面具有極大的應(yīng)用價值。眾所周知，人類和嚙齒類動物角膜內(nèi)皮組織起源于神經(jīng)嵴的眼周間葉組織。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在體外可大量擴(kuò)增并具有多向分化的潛能。因此，其是體外替代角膜內(nèi)皮細(xì)胞的理想種子細(xì)胞來源。 本研究中，我們通過共培養(yǎng)體系成功將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成具有類似內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)、標(biāo)志物及功能特性的內(nèi)皮樣細(xì)胞。 第一部分：人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)和鑒定 目的：建立人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)和鑒定的方法。 方法：用膠原酶消化法分離人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，并置于37℃，5%CO2孵育箱中培養(yǎng)，待其貼壁傳代后于倒置顯微鏡下行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察；流式細(xì)胞儀檢測其表面抗原表型；堿性磷酸酶及茜素紅染色鑒定其成骨誘導(dǎo)后的鈣質(zhì)沉積，油紅O用于成脂誘導(dǎo)后脂滴染色觀察。 結(jié)果：我們利用膠原酶消化法成功分離培養(yǎng)出人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，細(xì)胞表達(dá)多種抗原表型，如CD29, CD44, CD90和CD105，但不表達(dá)造血細(xì)胞及與移植排斥相關(guān)的抗原表型，如CD14, CD31, CD34, CD40, CD45和HLA-DR。在條件培養(yǎng)中可誘導(dǎo)分化為骨和脂肪細(xì)胞。 結(jié)論：通過膠原酶消化法可成功分離培養(yǎng)出人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；分離培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞具有間充質(zhì)干細(xì)胞的抗原表型和具有多向分化的潛能。 第二部分：兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)和鑒定 目的：建立兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞分離、培養(yǎng)和鑒定的方法。 方法：將帶有角膜內(nèi)皮細(xì)胞的后彈力層完整剝離后，用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA混合液于37℃，5%CO2孵育箱中行消化處理。待角膜內(nèi)皮細(xì)胞貼壁傳代后于倒置顯微鏡下行細(xì)胞形態(tài)學(xué)及HE染色觀察。掃描電鏡觀察兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，免疫熒光及免疫組織化學(xué)染色鑒定其表面蛋白標(biāo)志物ZO-1（緊密連接蛋白）和NSE（神經(jīng)元特異性烯醇化酶）。 結(jié)果：我們通過后彈力層揭除聯(lián)合胰酶消化法成功分離培養(yǎng)出兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞。原代培養(yǎng)的兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)呈多邊形，，表面富含微絨毛，細(xì)胞間緊密連接，約10天后可融合形成鋪路石樣的外觀。分離培養(yǎng)的兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞能夠表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞的蛋白標(biāo)志物ZO-1和NSE。 結(jié)論：通過后彈力層揭除聯(lián)合胰酶消化法可成功分離培養(yǎng)出兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞，且其具有角膜內(nèi)皮細(xì)胞所固有的特性。 第三部分：共培養(yǎng)體系下誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞分化的初步實驗研究 目的：通過與兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞行體外共培養(yǎng)，觀察人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞是否能向角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化。 方法：利用Transwell共培養(yǎng)體系，將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，誘導(dǎo)分化7天后的細(xì)胞行倒置顯微鏡和原子力顯微鏡下觀察形態(tài)。CCK-8檢測誘導(dǎo)分化細(xì)胞的增殖活性，實時熒光定量PCR和Western blot檢測誘導(dǎo)分化細(xì)胞的相關(guān)內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志物蛋白（緊密連接蛋白、神經(jīng)鈣黏素和神經(jīng)元特異性烯醇化酶）及特異性轉(zhuǎn)錄因子（FoxC1和Pitx2）的表達(dá)情況。 結(jié)果：共培養(yǎng)誘導(dǎo)分化后細(xì)胞的增殖、周期及凋亡與誘導(dǎo)前相比無明顯差異。與兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)7天后，紡錘形的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞已逐漸向卵圓形和多角形的細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變，且能夠表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞相對特異性的標(biāo)志物蛋白（ZO-1、N-cadherin和NSE）及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（FoxC1和Pitx2）。 結(jié)論：通過與兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)后，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞可被誘導(dǎo)分化為角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞。
【關(guān)鍵詞】：人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 角膜內(nèi)皮細(xì)胞 組織工程 人工角膜
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R77
【目錄】：

• 中文摘要3-6
• Abstract6-10
• 目錄10-12
• 前言12-18
• 第一部分：人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定18-31
• 引言18-19
• 材料與方法19-24
• 結(jié)果24-28
• 討論28-31
• 第二部分：兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定31-43
• 引言31-32
• 材料與方法32-37
• 結(jié)果37-40
• 討論40-43
• 第三部分：共培養(yǎng)體系下誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞分化的初步實驗研究43-62
• 引言43-44
• 材料與方法44-54
• 結(jié)果54-59
• 討論59-62
• 參考文獻(xiàn)62-77
• 全文總結(jié)77-78
• 問題和展望78-79
• 主要英文名詞縮略表79-81
• 在校期間發(fā)表的論文及科研成果81-83
• 致謝83

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本文編號：342763