本文關(guān)鍵詞：色素上皮衍生因子對(duì)大鼠角膜新生血管抑制作用的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景 正常角膜是無(wú)血管的、透明的結(jié)締組織,它具有眼部的機(jī)械屏障和屈光間質(zhì)的作用。同時(shí)角膜也是一個(gè)免疫豁免的組織,這也是角膜移植成功率較高的原因。血管生成是指新的血管從預(yù)先存在的血管結(jié)構(gòu)中生長(zhǎng)出來(lái)的過(guò)程,許多病理?xiàng)l件都可能導(dǎo)致角膜新生血管的產(chǎn)生,并導(dǎo)致嚴(yán)重的后果。引起角膜新生血管的原因有：感染性和免疫性疾病、眼外傷、佩戴角膜接觸鏡等。角膜新生血管可影響視力,也是角膜移植術(shù)后發(fā)生移植排斥反應(yīng)的高危因素,并導(dǎo)致炎癥、角膜瘢痕和水腫產(chǎn)生。 角膜新生血管的形成是一個(gè)復(fù)雜的病理過(guò)程,確切發(fā)病機(jī)制目前仍不清楚,主要有以下幾種學(xué)說(shuō)(1)缺氧學(xué)說(shuō)(2)炎癥學(xué)說(shuō)(3)消除角膜水腫的機(jī)械屏障破壞(4)細(xì)胞因子平衡學(xué)說(shuō)。目前多數(shù)學(xué)者傾向于細(xì)胞因子平衡學(xué)說(shuō),認(rèn)為新生血管刺激因子與抑制因子之間的平衡失調(diào)是新生血管形成的重要機(jī)制。 基于細(xì)胞因子平衡學(xué)說(shuō),目前對(duì)于新生血管性疾病治療的研究著眼于血管生成之間的平衡,一方面可以加強(qiáng)新生血管抑制因素,另一方面可削弱新生血管刺激因素。色素上皮衍生因子(pigment epithelium derived factor, PEDF),是絲氨酸蛋白酶抑制劑家族中的非抑制性成員,是由單基因編碼、相對(duì)分子質(zhì)量為50000的糖蛋白,存在于所有的脊椎動(dòng)物中,在不同物種間高度保守。它是一種多功能蛋白,已證實(shí)的功能包括神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)、親神經(jīng)元性、神經(jīng)保護(hù)、膠質(zhì)抑制、抗腫瘤、抗新生血管和抗血管滲漏。在抗新生血管方面,PEDF是已知最強(qiáng)的內(nèi)源性血管抑制因子,是“加強(qiáng)新生血管抑制因素”最主要的方式,它在正常人眼組織中高表達(dá),被認(rèn)作是維持角膜、玻璃體無(wú)血管的關(guān)鍵因素。Avastin是VEGF-A的單克隆抗體,是“削弱新生血管刺激因素”最主要的藥物,其用于抑制角膜新生血管已開展較多實(shí)驗(yàn)研究,也有臨床報(bào)告,顯示出較好的療效。為了研究PEDF對(duì)角膜新生血管的作用,本實(shí)驗(yàn)首先建立堿燒傷誘導(dǎo)大鼠角膜新生血管模型,然后運(yùn)用PEDF制成滴眼液觀察其對(duì)新生血管的抑制作用,并與Avastin組比較,同時(shí)設(shè)立地塞米松組作為對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)。 第一部分堿燒傷大鼠角膜新生血管模型的建立 目的 探索堿燒傷誘導(dǎo)大鼠角膜新生血管(CNV)動(dòng)物模型的建立,為下一步的實(shí)驗(yàn)提供穩(wěn)定可靠的動(dòng)物模型。 方法 隨機(jī)將/24只)SD大鼠分成3組,每組8只,右眼作為實(shí)驗(yàn)眼,左眼作為正常對(duì)照眼。采用浸潤(rùn)lmol/L氫氧化鈉的3mm濾紙片,分別制作燒灼時(shí)間為20s、30s、45s的堿燒傷鼠眼模型,每天裂隙燈觀察角膜新生血管生長(zhǎng)的情況,觀察7d。 結(jié)果 燒傷后7d,20s、30s和45s組CNV誘導(dǎo)率分別為62.7%、100%、100%,20s誘導(dǎo)率組分別與30s、45s組具有顯著性差異(P0.05)。20s組CNV長(zhǎng)至燒灼區(qū),散在稀疏分布,呈單條狀；30s組CNV深入燒灼區(qū),CNV致密,連接成網(wǎng)狀,生長(zhǎng)均勻一致；45s組50%的實(shí)驗(yàn)眼出現(xiàn)較為嚴(yán)重的前房積血,影響到新生血管的觀察。 結(jié)論 采用浸潤(rùn)lmol/L氫氧化鈉溶液的3mm濾紙片燒灼中央角膜30s的大鼠模型是角膜新生血管較理想的動(dòng)物模型。 第二部分PEDF抑制堿燒傷誘導(dǎo)大鼠角膜新生血管的研究 目的 觀察局部應(yīng)用PEDF對(duì)大鼠堿燒傷后角膜新生血管的抑制作用,并與Avastin比較；并初步探討PEDF抑制角膜新生血管的機(jī)制。 方法 1.建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型與分組：以右眼作為實(shí)驗(yàn)眼,左眼為正常對(duì)照眼,建立堿燒傷誘導(dǎo)大鼠角膜新生血管模型,將40只SD大鼠隨機(jī)分為A、B、C、D4組,每組10只。A組于燒傷當(dāng)天開始點(diǎn)用10μg/ml PEDF滴眼液；B組于燒傷當(dāng)天開始使用5mg/ml Avastin滴眼液；C組于燒傷當(dāng)天開始使用0.1%地塞米松磷酸鈉滴眼液；D組于燒傷當(dāng)天開始點(diǎn)用生理鹽水。均每日4次,每次10μL,共用12日。 2.角膜新生血管的觀察：從燒傷后第1天開始,每日用裂隙燈顯微鏡觀察角膜新生血管生長(zhǎng)情況,于第7天行角膜燒傷程度分級(jí),于第3、7、12天測(cè)量CNV長(zhǎng)度和計(jì)算CNV面積,并于第12天照相。 3.組織病理學(xué)檢查：燒傷后第12天,每組隨機(jī)取5只大鼠,麻醉后采用頸椎脫臼法處死,迅速摘除眼球,沿角膜緣剪下角膜組織,置于4%多聚甲醛溶液中固定,石蠟包埋后做4μm連續(xù)切片,取其中一份,常規(guī)蘇木精-伊紅染色,中性樹膠封片,光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。 4.免疫組織化學(xué)檢測(cè)VEGF、CD31表達(dá)：各取一份切片分別行VEGF和CD31免疫組織化學(xué)染色。二甲苯脫蠟,3%過(guò)氧化氫室溫濕盒孵育10min, PBS清洗。在包含0.05%胰蛋白酶的山羊血清中孵化30分鐘。一抗4℃孵育過(guò)夜,二抗室溫下孵育30min。DAB顯色,蘇木素復(fù)染、水洗、返藍(lán)。乙醇梯度脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,光鏡下觀察并拍照。 5.免疫印跡法檢測(cè)大鼠角膜VEGF的表達(dá)：在上述時(shí)間點(diǎn)處死每組其余5只大鼠,取下角膜組織并立刻凍存在液化氮中,將角膜樣本在裂解液中均質(zhì)化,提取實(shí)驗(yàn)眼角膜總組織蛋白,每泳道上樣等質(zhì)量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜,印跡膜在放入盛有5%脫脂奶粉溶液的平皿中,37℃搖床內(nèi)孵育1h,封閉非特異性抗原,加入一抗,4℃過(guò)夜孵育,洗膜,加入二抗,室溫孵育1h, PBST洗膜,ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè),β-actin為內(nèi)對(duì)照。圖片采用image J軟件分析。 結(jié)果 1.CNV的觀察堿燒傷后24h,各組角膜緣血管網(wǎng)充盈,角膜中央渾濁水腫,未見(jiàn)新生血管長(zhǎng)入；第3天,D組新生血管芽深入角膜緣,新生血管密集,在角膜上方呈刷狀迅速生長(zhǎng)；A、B、C組新生血管相對(duì)稀疏,長(zhǎng)勢(shì)較緩；第12天時(shí)A組新生血管未達(dá)燒灼區(qū),血管細(xì)小,色淡,稀疏,B、C組新生血管較短,血管剛達(dá)燒灼區(qū),末梢血管有交聯(lián),血管較細(xì)小；D組新生血管接近角膜中央,血管密集,粗大。 2.不同時(shí)間點(diǎn)各組CNV面積(mm2)各時(shí)間點(diǎn)A、B、C組角膜新生血管面積均小于D組(P0.01)。第三天時(shí),A、B、C組之間兩兩相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；第七天與第十二天,A組角膜新生血管面積均小于B、C組(P0.01),B組與C組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 3.組織病理學(xué)觀察第12天,A組新生血管較少,管腔小且較為稀疏,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)少,角膜組織結(jié)構(gòu)趨于整齊；B、C組新生血管增多,未見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),角膜組織結(jié)構(gòu)相對(duì)整齊,D組角膜基質(zhì)層見(jiàn)大量新生血管,管腔大且密集,血管腔內(nèi)可見(jiàn)較多成熟的紅細(xì)胞,周圍大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),角膜組織結(jié)構(gòu)紊亂。正常對(duì)照眼無(wú)新生血管,組織排列整齊。 4. VEGF和CD31免疫組織化學(xué)分析正常對(duì)照眼無(wú)新生血管,VEGF僅在角膜上皮層和內(nèi)皮層有微弱的表達(dá)；A組新生血管稀少,VEGF在角膜上皮、內(nèi)皮層及基質(zhì)層少量表達(dá)；B、C組新生血管密度增高,VEGF表達(dá)增多；D組新生血管密集而粗大,角膜上皮和基質(zhì)層可見(jiàn)VEGF大量表達(dá),主要分布于上皮全層和新生血管區(qū)域。CD31是血管內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志物,正常對(duì)照眼未見(jiàn)CD31陽(yáng)性表達(dá)；A組表達(dá)較弱；B、C組表達(dá)增強(qiáng)；D組可見(jiàn)CD31大量表達(dá),主要分布于新生血管區(qū)域。 5.角膜組織VEGF免疫印跡結(jié)果結(jié)果顯示A、B、C組的VEGF表達(dá)均較D組低(P0.01),而A組表達(dá)較B、C組低(P0.01),B組與C組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論 1.大鼠角膜堿燒傷后局部應(yīng)用PEDF有抑制角膜新生血管的作用。 2. PEDF對(duì)角膜新生血管的抑制作用強(qiáng)于Avastin和地塞米松。 3. PEDF可能通過(guò)下調(diào)VEGF和控制炎癥反應(yīng)抑制角膜新生血管。 4. PEDF有一定的抗炎作用。
【關(guān)鍵詞】：角膜 新生血管 色素上皮衍生因子 貝伐單抗
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R772.2
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-15
• 前言15-20
• 參考文獻(xiàn)17-20
• 第一部分 堿燒傷大鼠角膜新生血管模型的建立20-28
• 1.1 材料和方法20-22
• 1.2 結(jié)果22-24
• 1.3 討論24-26
• 參考文獻(xiàn)26-28
• 第二部分 PEDF對(duì)堿燒傷誘導(dǎo)大鼠角膜新生血管抑制作用的研究28-51
• 2.1 材料與方法28-37
• 2.2 結(jié)果37-45
• 2.3 討論45-47
• 參考文獻(xiàn)47-51
• 問(wèn)題與展望51-52
• 綜述52-70
• 參考文獻(xiàn)62-70
• 攻讀碩士期間發(fā)表的論文及成果70-71
• 致謝71-72

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 李玉梅;陳永強(qiáng);;缺氧誘導(dǎo)因子-1與腫瘤細(xì)胞凋亡及血管生成關(guān)系的研究進(jìn)展[J];中華腫瘤防治雜志;2008年12期

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3 趙 巍,張曉農(nóng);大鼠角膜新生血管模型中基質(zhì)金屬蛋白酶-2及其抑制物的表達(dá)[J];眼科研究;2002年04期

  本文關(guān)鍵詞：色素上皮衍生因子對(duì)大鼠角膜新生血管抑制作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：320713