本文關鍵詞：色素上皮衍生因子對大鼠角膜新生血管抑制作用的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景 正常角膜是無血管的、透明的結締組織,它具有眼部的機械屏障和屈光間質的作用。同時角膜也是一個免疫豁免的組織,這也是角膜移植成功率較高的原因。血管生成是指新的血管從預先存在的血管結構中生長出來的過程,許多病理條件都可能導致角膜新生血管的產生,并導致嚴重的后果。引起角膜新生血管的原因有：感染性和免疫性疾病、眼外傷、佩戴角膜接觸鏡等。角膜新生血管可影響視力,也是角膜移植術后發(fā)生移植排斥反應的高危因素,并導致炎癥、角膜瘢痕和水腫產生。 角膜新生血管的形成是一個復雜的病理過程,確切發(fā)病機制目前仍不清楚,主要有以下幾種學說(1)缺氧學說(2)炎癥學說(3)消除角膜水腫的機械屏障破壞(4)細胞因子平衡學說。目前多數(shù)學者傾向于細胞因子平衡學說,認為新生血管刺激因子與抑制因子之間的平衡失調是新生血管形成的重要機制。 基于細胞因子平衡學說,目前對于新生血管性疾病治療的研究著眼于血管生成之間的平衡,一方面可以加強新生血管抑制因素,另一方面可削弱新生血管刺激因素。色素上皮衍生因子(pigment epithelium derived factor, PEDF),是絲氨酸蛋白酶抑制劑家族中的非抑制性成員,是由單基因編碼、相對分子質量為50000的糖蛋白,存在于所有的脊椎動物中,在不同物種間高度保守。它是一種多功能蛋白,已證實的功能包括神經營養(yǎng)、親神經元性、神經保護、膠質抑制、抗腫瘤、抗新生血管和抗血管滲漏。在抗新生血管方面,PEDF是已知最強的內源性血管抑制因子,是“加強新生血管抑制因素”最主要的方式,它在正常人眼組織中高表達,被認作是維持角膜、玻璃體無血管的關鍵因素。Avastin是VEGF-A的單克隆抗體,是“削弱新生血管刺激因素”最主要的藥物,其用于抑制角膜新生血管已開展較多實驗研究,也有臨床報告,顯示出較好的療效。為了研究PEDF對角膜新生血管的作用,本實驗首先建立堿燒傷誘導大鼠角膜新生血管模型,然后運用PEDF制成滴眼液觀察其對新生血管的抑制作用,并與Avastin組比較,同時設立地塞米松組作為對照標準。 第一部分堿燒傷大鼠角膜新生血管模型的建立 目的 探索堿燒傷誘導大鼠角膜新生血管(CNV)動物模型的建立,為下一步的實驗提供穩(wěn)定可靠的動物模型。 方法 隨機將/24只)SD大鼠分成3組,每組8只,右眼作為實驗眼,左眼作為正常對照眼。采用浸潤lmol/L氫氧化鈉的3mm濾紙片,分別制作燒灼時間為20s、30s、45s的堿燒傷鼠眼模型,每天裂隙燈觀察角膜新生血管生長的情況,觀察7d。 結果 燒傷后7d,20s、30s和45s組CNV誘導率分別為62.7%、100%、100%,20s誘導率組分別與30s、45s組具有顯著性差異(P0.05)。20s組CNV長至燒灼區(qū),散在稀疏分布,呈單條狀；30s組CNV深入燒灼區(qū),CNV致密,連接成網狀,生長均勻一致；45s組50%的實驗眼出現(xiàn)較為嚴重的前房積血,影響到新生血管的觀察。 結論 采用浸潤lmol/L氫氧化鈉溶液的3mm濾紙片燒灼中央角膜30s的大鼠模型是角膜新生血管較理想的動物模型。 第二部分PEDF抑制堿燒傷誘導大鼠角膜新生血管的研究 目的 觀察局部應用PEDF對大鼠堿燒傷后角膜新生血管的抑制作用,并與Avastin比較；并初步探討PEDF抑制角膜新生血管的機制。 方法 1.建立實驗動物模型與分組：以右眼作為實驗眼,左眼為正常對照眼,建立堿燒傷誘導大鼠角膜新生血管模型,將40只SD大鼠隨機分為A、B、C、D4組,每組10只。A組于燒傷當天開始點用10μg/ml PEDF滴眼液；B組于燒傷當天開始使用5mg/ml Avastin滴眼液；C組于燒傷當天開始使用0.1%地塞米松磷酸鈉滴眼液；D組于燒傷當天開始點用生理鹽水。均每日4次,每次10μL,共用12日。 2.角膜新生血管的觀察：從燒傷后第1天開始,每日用裂隙燈顯微鏡觀察角膜新生血管生長情況,于第7天行角膜燒傷程度分級,于第3、7、12天測量CNV長度和計算CNV面積,并于第12天照相。 3.組織病理學檢查：燒傷后第12天,每組隨機取5只大鼠,麻醉后采用頸椎脫臼法處死,迅速摘除眼球,沿角膜緣剪下角膜組織,置于4%多聚甲醛溶液中固定,石蠟包埋后做4μm連續(xù)切片,取其中一份,常規(guī)蘇木精-伊紅染色,中性樹膠封片,光學顯微鏡下觀察并拍照。 4.免疫組織化學檢測VEGF、CD31表達：各取一份切片分別行VEGF和CD31免疫組織化學染色。二甲苯脫蠟,3%過氧化氫室溫濕盒孵育10min, PBS清洗。在包含0.05%胰蛋白酶的山羊血清中孵化30分鐘。一抗4℃孵育過夜,二抗室溫下孵育30min。DAB顯色,蘇木素復染、水洗、返藍。乙醇梯度脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,光鏡下觀察并拍照。 5.免疫印跡法檢測大鼠角膜VEGF的表達：在上述時間點處死每組其余5只大鼠,取下角膜組織并立刻凍存在液化氮中,將角膜樣本在裂解液中均質化,提取實驗眼角膜總組織蛋白,每泳道上樣等質量蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳,將蛋白轉至硝酸纖維素膜,印跡膜在放入盛有5%脫脂奶粉溶液的平皿中,37℃搖床內孵育1h,封閉非特異性抗原,加入一抗,4℃過夜孵育,洗膜,加入二抗,室溫孵育1h, PBST洗膜,ECL化學發(fā)光法檢測,β-actin為內對照。圖片采用image J軟件分析。 結果 1.CNV的觀察堿燒傷后24h,各組角膜緣血管網充盈,角膜中央渾濁水腫,未見新生血管長入；第3天,D組新生血管芽深入角膜緣,新生血管密集,在角膜上方呈刷狀迅速生長；A、B、C組新生血管相對稀疏,長勢較緩；第12天時A組新生血管未達燒灼區(qū),血管細小,色淡,稀疏,B、C組新生血管較短,血管剛達燒灼區(qū),末梢血管有交聯(lián),血管較細��；D組新生血管接近角膜中央,血管密集,粗大。 2.不同時間點各組CNV面積(mm2)各時間點A、B、C組角膜新生血管面積均小于D組(P0.01)。第三天時,A、B、C組之間兩兩相比,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)；第七天與第十二天,A組角膜新生血管面積均小于B、C組(P0.01),B組與C組相比,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。 3.組織病理學觀察第12天,A組新生血管較少,管腔小且較為稀疏,炎癥細胞浸潤少,角膜組織結構趨于整齊；B、C組新生血管增多,未見大量炎性細胞浸潤,角膜組織結構相對整齊,D組角膜基質層見大量新生血管,管腔大且密集,血管腔內可見較多成熟的紅細胞,周圍大量炎性細胞浸潤,角膜組織結構紊亂。正常對照眼無新生血管,組織排列整齊。 4. VEGF和CD31免疫組織化學分析正常對照眼無新生血管,VEGF僅在角膜上皮層和內皮層有微弱的表達；A組新生血管稀少,VEGF在角膜上皮、內皮層及基質層少量表達；B、C組新生血管密度增高,VEGF表達增多；D組新生血管密集而粗大,角膜上皮和基質層可見VEGF大量表達,主要分布于上皮全層和新生血管區(qū)域。CD31是血管內皮細胞的標志物,正常對照眼未見CD31陽性表達；A組表達較弱；B、C組表達增強；D組可見CD31大量表達,主要分布于新生血管區(qū)域。 5.角膜組織VEGF免疫印跡結果結果顯示A、B、C組的VEGF表達均較D組低(P0.01),而A組表達較B、C組低(P0.01),B組與C組相比,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。 結論 1.大鼠角膜堿燒傷后局部應用PEDF有抑制角膜新生血管的作用。 2. PEDF對角膜新生血管的抑制作用強于Avastin和地塞米松。 3. PEDF可能通過下調VEGF和控制炎癥反應抑制角膜新生血管。 4. PEDF有一定的抗炎作用。
【關鍵詞】：角膜 新生血管 色素上皮衍生因子 貝伐單抗
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R772.2
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-15
• 前言15-20
• 參考文獻17-20
• 第一部分 堿燒傷大鼠角膜新生血管模型的建立20-28
• 1.1 材料和方法20-22
• 1.2 結果22-24
• 1.3 討論24-26
• 參考文獻26-28
• 第二部分 PEDF對堿燒傷誘導大鼠角膜新生血管抑制作用的研究28-51
• 2.1 材料與方法28-37
• 2.2 結果37-45
• 2.3 討論45-47
• 參考文獻47-51
• 問題與展望51-52
• 綜述52-70
• 參考文獻62-70
• 攻讀碩士期間發(fā)表的論文及成果70-71
• 致謝71-72

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 李玉梅;陳永強;;缺氧誘導因子-1與腫瘤細胞凋亡及血管生成關系的研究進展[J];中華腫瘤防治雜志;2008年12期

2 滕旭,孫旭光,王智群;血管內皮生長因子與大鼠角膜新生血管生長及退化的相關性實驗研究[J];眼科新進展;2002年03期

3 趙 巍,張曉農;大鼠角膜新生血管模型中基質金屬蛋白酶-2及其抑制物的表達[J];眼科研究;2002年04期

  本文關鍵詞：色素上皮衍生因子對大鼠角膜新生血管抑制作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：320713