本文關鍵詞：腫瘤抑素對恒河猴脈絡膜—視網膜血管內皮細胞生長影響的實驗研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景流行病學研究表明,隨著感染性眼病控制,新生血管性眼病已成為發(fā)達國家失明的重要原因,而視網膜新生血管(retinal neovascularization, RNV)性疾病是目前主要的致盲眼病,但目前的治療效果均不理想。新生血管的生成是血管內皮細胞不斷分裂增殖和遷移的復雜過程,目前用于治療研究的藥物主要有血管生成因子表達的抑制劑如抗VEGF抗體和內源性血管生成抑制因子如內皮抑素(Endostatin, ES)等,腫瘤抑素是迄今發(fā)現(xiàn)活性最強的內源性血管生成抑制因子,對病理性新生血管生成有明顯抑制作用。 目的構建及鑒定經信號肽優(yōu)化后帶有HA-tag標記的攜帶人腫瘤抑素(Tumstatin)活性片段Tum-5基因真核表達載體并研究抗腫瘤血管生成抑制基因Tum-5對恒河猴脈絡膜-視網膜血管內皮細胞(rhesus choroidoretinal endothelial cell, RF/6A)生長的影響。 方法本研究包括兩部分：1.設計并構建經信號肽優(yōu)化后帶有HA-tag標記的攜帶Tum5重組基因真核表達載體PCMV-Tum5-MCS,通過酶切、測序驗證Tum5基因構建情況；2.利用脂質體Lipofectamine2000轉染系統(tǒng)將PCMV-Tum5-MCS質粒載體轉染入體外培養(yǎng)的RF/6A細胞(轉染實驗組),同時設置空質粒載體陰性對照組和未轉染組；采用Dot blot方法用HA抗體檢測細胞上清液中Tum5蛋白的表達水平；通過MTT法檢測細胞轉染后24h、48h和72h三個不同時相點細胞增殖抑制率；利用體外細胞劃痕試驗,分別考察在0h、24h、48h三個不同時相點,Tumm5與RF/6A遷移與侵襲的關系；運用流式細胞術比較三組細胞轉染48h后細胞周期情況。 結果1.經過酶切,測序鑒定PCMV-Tum5-MCS真核表達載體構建成功；2.瞬時轉染Tumm-5載體構建成功；3.Dot blot法檢測出Tum5基因在RF/6A細胞上清中蛋白表達成陽性；4.轉染后24h、48h和72h,轉染實驗組細胞增殖抑制率均明顯高于空白對照組和空質粒陰性對照組(P0.05),其中各組細胞轉染72h后增殖抑制率均高于48h、24h(P0.05)；5.細胞劃痕實驗結果表明,Tum5基因對RF/6A細胞的遷移率較空白對照組及陰性對照組明顯下降(P0.05)；6.流式細胞術結果顯示：正常細胞組G1期72.32%G2期7.22%S期20.46%,空質粒載體陰性對照組G1期75.92%G2期3.23%S期20.84%PCMV-Tum5-MCS質粒載體轉染組G1期65.21%G2期4.79%S期30.00%,PCMV-Tum5-MCS質粒載體轉染組G1期比例下降,S期比例顯著上升,正常細胞組和空質粒載體轉染組沒有明顯差異。 結論成功構建了攜帶Tum5基因的真核表達載體,體外轉染RF/6A后能夠穩(wěn)定表達Tum5基因,具有抑制RF/6A增殖,移行的功能,使細胞周期阻滯于S期。為進一步研究Tum5的功能和眼部新生血管疾病的治療奠定基礎。
【關鍵詞】：視網膜新生血管 腫瘤抑素 血管生成 眼科 增殖
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R774.1
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• ~.略語/符號說明10-11
• 前言11-13
• 研究現(xiàn)狀、成果11-12
• 研究目的、方法12-13
• 一、經信號肽優(yōu)化后攜帶人腫瘤抑素(tumstatin)活性片段Tum-5基因的真核表達載體的構建及鑒定13-29
• 1.1 材料和方法13-20
• 1.1.1 實驗材料13-14
• 1.1.2 經信號肽優(yōu)化后攜帶人腫瘤抑素(tumstatin)活性片段Tum-5基因重組質粒PCMV-Tum5-MCS的構建14-19
• 1.1.3 重組質粒PCMV-Tum5-MCS的鑒定19-20
• 1.2 結果20-26
• 1.2.1 質粒圖譜20-21
• 1.2.2 目的基因TA克隆后測序結果21
• 1.2.3 重組質粒PCMV-Tum5-MCS的PCR產物電泳結果21-22
• 1.2.4 重組質粒PCMV-Tum5-MCS的雙酶切鑒定22-23
• 1.2.5 重組質粒PCMV-Tum5-MCS的測序鑒定23-26
• 1.3 討論26-28
• 1.3.1 腫瘤抑素研究進展26-27
• 1.3.2 腫瘤抑素重組基因載體構建27-28
• 1.4 小結28-29
• 二、Tum-5基因對猴脈絡膜-視網膜血管內皮細胞生長的影響29-47
• 2.1 材料和方法29-38
• 2.1.1 細胞株及主要試劑29-31
• 2.1.2 實驗方法31-37
• 2.1.3 統(tǒng)計學處理37-38
• 2.2 結果38-43
• 2.2.1 PCMV-Tum5-MCS轉染RF/6A細胞38
• 2.2.2 斑點印跡法檢測RF/6A細胞Tum5蛋白表達38-39
• 2.2.3 MTT法檢測PCMV-Tum5-MCS對RF/6A細胞增殖的影響39-40
• 2.2.4 細胞劃痕實驗檢測PCMV-Tum5-MCS對RF/6A細胞移行的作用效應40-42
• 2.2.5 RF/6A轉染Tum5細胞周期檢測42-43
• 2.3 討論43-46
• 2.3.1 腫瘤抑素因子與新生血管性眼病43-45
• 2.3.2 腫瘤抑素對RF/6A細胞生長的抑制作用45-46
• 2.4 小結46-47
• 結論47-48
• 參考文獻48-52
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明52-53
• 綜述53-68
• 綜述參考文獻62-68
• 致謝68

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前3條

1 孫靖;李筱榮;;靶向血管內皮生長因子治療眼新生血管的研究進展[J];眼科新進展;2008年01期

2 黃敏麗;羅國容;陳維平;何少健;陳芳;;Tumstatin肽對視網膜微血管內皮細胞增生和遷移的影響[J];眼科新進展;2008年09期

3 彭淑平,方唯意,蔣日成,周建國,董琳,曹建國;血管基膜衍生多功能肽在大腸桿菌中的表達及抗腫瘤活性的測定[J];中國藥理學通報;2003年06期

  本文關鍵詞：腫瘤抑素對恒河猴脈絡膜—視網膜血管內皮細胞生長影響的實驗研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：318773