目的:探討TIGAR（TP53‐induced glycolysis and apoptosis regulator）基因沉默后對(duì)鼻咽癌5-8F細(xì)胞自噬、凋亡、線粒體降解及線粒體形態(tài)、功能的影響。方法:1、體外培養(yǎng)鼻咽癌5-8F細(xì)胞系;通過(guò)慢病毒介導(dǎo)的特異性shRNA干擾TIGAR表達(dá),并通過(guò)免疫熒光分析、Western blot檢測(cè)TIGAR在胞質(zhì)及線粒體內(nèi)表達(dá)水平變化;2、流式細(xì)胞儀分析沉默TIGAR基因后細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物還原型谷胱甘肽（GSH）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）及活性氧（ROS）含量變化,評(píng)估細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平;3、Western blot檢測(cè)主要的細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin-1及P62表達(dá)水平變化,分析細(xì)胞自噬活性變化;4、JC-1染色細(xì)胞檢測(cè)線粒體膜電位變化;5、分離細(xì)胞質(zhì)蛋白及線粒體蛋白通過(guò)Western blot檢測(cè)凋亡蛋白細(xì)胞色素c在線粒體與胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)水平變化;流式分析檢測(cè)Annexin V/PI染色細(xì)胞凋亡率;6、Western blot檢測(cè)線粒體自噬蛋白PINK1及Parkin表達(dá)水平變化;線粒體綠色熒光探針標(biāo)記線粒體,通過(guò)流式分析線粒體數(shù)量變化,... 

【文章來(lái)源】：西南醫(yī)科大學(xué)四川省

【文章頁(yè)數(shù)】：60 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

A.TIGAR在5-8F細(xì)胞線粒體內(nèi)表達(dá)變化（SP×400）；mtHSP70標(biāo)記線粒體

既往研究證明 TIGAR 沉默表達(dá)后磷酸戊糖途徑 NADPH 產(chǎn)內(nèi)氧化型谷胱甘肽（GSSG）還原為還原型谷胱甘肽（GSH使過(guò)多的活性氧（ROS）堆積，使細(xì)胞不能維持正常的氧化應(yīng)激增加。ROS 可參與多種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)細(xì)胞自亡，近年來(lái)多項(xiàng)研究表明，ROS 還參與 TIGAR 對(duì)腫瘤細(xì)等相關(guān)途徑的調(diào)控。因此我們通過(guò)流式分析及酶標(biāo)儀分別R 干擾后 5-8F 細(xì)胞內(nèi)活性氧、谷胱甘肽含量變化，發(fā)現(xiàn) TIG5-8F 細(xì)胞內(nèi) GSSG 比例升高（P=0.005, 圖 2B），ROS 水平0.021, 圖 2A）。擾 TIGAR 后 5-8F 細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)改變

LC3-II 蛋白與聚泛素化蛋白形成復(fù)合物，通過(guò)這種泛素信號(hào)途徑轉(zhuǎn)運(yùn)聚的蛋白質(zhì)、損傷的胞器最終在溶酶體內(nèi)降解，在自噬的過(guò)程中，P62 也斷被消耗[29]，因此這三個(gè)蛋白被用來(lái)作為檢測(cè)自噬水平的關(guān)鍵指標(biāo)。研究通過(guò) Western blot 分析檢測(cè) 5-8F 細(xì)胞自噬標(biāo)志分子 Beclin1、LC3P62 蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示相對(duì)于 sh-Scramble 細(xì)胞，sh-TIGAR 細(xì)Beclin1、LC3-II/LC3-I 表達(dá)顯著上升，同時(shí) P62 表達(dá)下降（圖 3），說(shuō)沉默 TIGAR 后，5-8F 細(xì)胞自噬增強(qiáng)。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號(hào)：2926532