本文關(guān)鍵詞：高血糖對(duì)骨髓來源細(xì)胞參與脈絡(luò)膜新生血管的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景：年齡相關(guān)性黃斑變性（AMD）、眼組織胞漿菌病及病理性近視等眼部多種致盲性疾病，其共同病理改變?yōu)槊}絡(luò)膜新生血管（CNV）的生成。CNV的生成包括血管生成（angiogenesis）和血管發(fā)生（vascularization）兩種形式，前者指原位血管細(xì)胞參與形成新生血管，后者則為骨髓來源細(xì)胞（BMCs）分化的血管細(xì)胞參與形成新血管的過程。炎癥、缺氧和應(yīng)激損傷等多種因素，均可影響CNV的發(fā)生與發(fā)展。 糖尿病是常見的慢性代謝性疾病，其持續(xù)的高血糖狀態(tài)可導(dǎo)致全身多個(gè)組織器官損傷。在眼部，最常見的并發(fā)癥是糖尿病視網(wǎng)膜病變（DR）。DR基本的病理變化為微血管病變，，在疾病晚期常表現(xiàn)為視網(wǎng)膜新生血管的生成。AMD是最常見的以CNV為病理特征的疾病，在新生血管形成的誘發(fā)因素及病理改變等方面，與DR有著諸多相似之處。有流行病學(xué)研究提示，糖尿病可能是AMD（尤其是新生血管性AMD）發(fā)生與發(fā)展的又一危險(xiǎn)因素。 我組前期研究顯示，高血糖加重CNV的嚴(yán)重程度，并可促進(jìn)BMCs趨化至CNV并參與新生血管的發(fā)生。然而，由于所采用的細(xì)胞學(xué)和組織學(xué)的研究方法存在局限性，因此尚未能在造模后多個(gè)時(shí)間點(diǎn)實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)觀察高血糖對(duì)BMCs參與CNV發(fā)生與發(fā)展的影響。在體生物發(fā)光成像（BLI）是一項(xiàng)新興的分子影像學(xué)技術(shù)，具有無創(chuàng)、高靈敏度及可實(shí)時(shí)觀察等優(yōu)點(diǎn)。雖然我組已將BLI用于BMCs參與CNV發(fā)生與發(fā)展過程的動(dòng)態(tài)觀察，但尚未實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)高血糖條件下BMCs是如何參與CNV的發(fā)生與發(fā)展。 目的：應(yīng)用BLI、組織學(xué)及分子生物學(xué)方法，動(dòng)態(tài)觀察CNV造模后不同時(shí)間點(diǎn)高血糖對(duì)BMCs向眼部的趨化以及對(duì)CNV的影響。 方法：獲取熒光素酶-綠色熒光蛋白（Fluc-GFP）雙轉(zhuǎn)基因小鼠的BMCs，采用尾靜脈注射移植給野生型C57BL/6J小鼠構(gòu)建嵌合體，嵌合度85%的小鼠納入實(shí)驗(yàn)。參與實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物隨機(jī)分為5組，即正常血糖嵌合體小鼠（Normal）組、高血糖嵌合體小鼠（DM）組、正常血糖嵌合體小鼠CNV（Normal+CNV）組、高血糖嵌合體小鼠CNV（DM+CNV）組及接受Co60照射但未行骨髓移植的野生型C57小鼠為陰性對(duì)照（Control）組。其中高血糖模型的建立，采用腹腔內(nèi)鏈尿佐菌素（STZ，50mg/kg，連續(xù)5天）注射，血糖濃度15mmol/L者視為糖尿病模型小鼠，而正常血糖嵌合體小鼠不進(jìn)行注射。另采用532nm倍頻激光視網(wǎng)膜光凝法誘導(dǎo)CNV。各組模型構(gòu)建成功后：（1）采用IVIS Kinetics小動(dòng)物成像系統(tǒng)，于CNV建模后第1、3、5、7、14、21和28天，對(duì)5組小鼠的眼部發(fā)光信號(hào)進(jìn)行BLI動(dòng)態(tài)檢測(cè)；（2）CNV造模后第7天剝?nèi)⌒∈竺}絡(luò)膜組織并制成勻漿液，以體外熒光素酶定量測(cè)定Normal+CNV組和DM+CNV組小鼠眼部熒光強(qiáng)度，通過螢火蟲熒光素酶活性（RLU1）、海腎熒光素酶活性（RLU2）和RLU1/RLU2（即RIOT）測(cè)定小鼠眼部CNV的BMCs數(shù)量；（3）CNV模型建立后，分別在第1、3、5、7、14、21和28天脫臼頸椎處死小鼠，制備視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜組織切片行HE染色，比較Normal+CNV組和DM+CNV組小鼠CNV的長度和厚度；（4）CNV建模后第7天行脈絡(luò)膜鋪片，比較Normal+CNV組和DM+CNV組小鼠CNV的面積；（5）CNV模型建立后第1、3、5、7、14、21和28天，收集Normal+CNV組和DM+CNV組小鼠RPE-脈絡(luò)膜-鞏膜復(fù)合體標(biāo)本，以Western blot檢測(cè)VEGF和SDF-1蛋白表達(dá)。 結(jié)果：（1）將Fluc-GFP雙轉(zhuǎn)基因小鼠BMCs移植給受體C57/BL6J小鼠后第28天，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)嵌合度，納入實(shí)驗(yàn)的嵌合體小鼠平均嵌合度為（88.85±2.46）%，糖尿病模型小鼠平均血糖濃度為（17.88±0.86）mmol/L，符合實(shí)驗(yàn)納入標(biāo)準(zhǔn)。（2）①Normal+CNV組小鼠在BLI觀察的第1天就有BMCs趨化至眼部，光學(xué)信號(hào)逐漸增強(qiáng)，于第7天達(dá)到峰值，隨后逐漸減弱。Normal組小鼠光學(xué)信號(hào)在整個(gè)觀察時(shí)像表現(xiàn)為平穩(wěn)的波動(dòng)。Normal+CNV組小鼠在建模后第1、3、5、7、14、21和28天光學(xué)信號(hào)顯著高于Normal組小鼠（t=19.545、14.572、23.172、11.329、16.439、17.382和7.616，P0.05）。②DM+CNV組小鼠在BLI觀察的第1天即可檢測(cè)到BMCs向眼部聚集，眼部光學(xué)信號(hào)在第7天達(dá)到峰值，隨后逐漸減弱。DM組小鼠光學(xué)信號(hào)從第1天到第28天表現(xiàn)為平穩(wěn)波動(dòng)，且信號(hào)強(qiáng)度在第1、3、5、7、14、21和28天明顯低于DM+CNV組小鼠（t=15.366、11.701、17.933、23.356、16.607、13.933和11.406，P0.05）。③CNV建模后第1天，光學(xué)信號(hào)即出現(xiàn)于Normal+CNV組和DM+CNV組小鼠眼部，第7天信號(hào)達(dá)到峰值，且DM+CNV組明顯強(qiáng)于Normal+CNV組，第14天后兩組信號(hào)開始減弱。CNV建模后第5、7、14和21天，DM+CNV組光學(xué)信號(hào)均顯著強(qiáng)于Normal+CNV組（t=3.869、3.551、6.142和3.021，P0.05）。（3）CNV造模后第7天，體外熒光素酶定量實(shí)驗(yàn)顯示DM+CNV組小鼠RLU1（707.33±88.65）明顯高于Normal+CNV組小鼠（255.00±52.02，t=28.88，P0.05）；DM+CNV組小鼠RIOT（1.83±0.17）明顯高于Normal+CNV組小鼠（0.90±0.17，t=8.448，P0.05）。（4）小鼠視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜組織HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CNV建模后第1、3、5、7、14、21和28天，新生血管穿過Bruch膜到達(dá)視網(wǎng)膜下腔。在第5、7、14和21天，DM+CNV組小鼠CNV長度顯著大于Normal+CNV組（t=7.513、11.224、9.509和9.732，P0.05）。而小鼠CNV的厚度差異在DM+CNV組與Normal+CNV組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.865、0.301、0.691、0.503、0.164、0.402和1.105，P0.05）。（5）CNV造模后第7天，DM+CNV組小鼠脈絡(luò)膜鋪片的CNV生成面積（32218.00±1687.16） μm2明顯大于Normal+CNV組小鼠（20688.67±1488.05μm2，t=4.820，P0.05）。（6）Western blot結(jié)果提示，DM+CNV組小鼠眼部VEGF和SDF-1蛋白的表達(dá)水平明顯高于Normal+CNV組小鼠（P0.05）。 結(jié)論：結(jié)合以往組織病理學(xué)結(jié)果，本研究采用BLI、組織學(xué)及分子生物學(xué)方法進(jìn)一步證實(shí)：CNV在建模后第7天發(fā)展至高峰，高血糖可直接加重CNV，并可通過促使更多BMCs趨化至小鼠眼部而間接加重CNV，這些作用與局部VEGF和SDF-1蛋白表達(dá)水平相關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：高血糖/藥物誘導(dǎo) 脈絡(luò)膜新生血管/光凝 骨髓來源細(xì)胞 在體生物發(fā)光成像 VEGF SDF-1
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R773.4
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 中文摘要7-10
• Abstract10-14
• 前言14-16
• 文獻(xiàn)回顧16-25
• 一、脈絡(luò)膜新生血管16-17
• 二、糖尿病對(duì) BMCs 的影響17-18
• 三、糖尿病與血管性疾病18-22
• 四、在體生物發(fā)光成像在眼部的應(yīng)用22-23
• 五、結(jié)語23-25
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料、試劑和儀器25-26
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物25
• 1.2 主要試劑25-26
• 1.3 儀器設(shè)備26
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法26-32
• 2.1 獲取 Fluc-GFP 雙轉(zhuǎn)基因小鼠 BMCs26-27
• 2.2 骨髓移植構(gòu)建小鼠嵌合體模型27
• 2.3 小鼠嵌合度分析27-28
• 2.4 構(gòu)建小鼠高血糖模型28
• 2.5 激光誘導(dǎo)小鼠 CNV 模型28
• 2.6 動(dòng)物分組28-29
• 2.7 在體生物發(fā)光成像29
• 2.8 體外熒光素酶定量29-30
• 2.9 脈絡(luò)膜鋪片30-31
• 2.10 組織病理學(xué)分析31-32
• 2.11 VEGF 和 SDF-1 蛋白表達(dá)豐度的檢測(cè)32
• 2.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析32
• 3. 結(jié)果32-44
• 3.1 Fluc-GFP 雙轉(zhuǎn)基因小鼠 BMCs 形態(tài)32-33
• 3.2 小鼠平均嵌合度和平均血糖濃度33
• 3.3 高血糖促進(jìn)小鼠 BMCs 參與 CNV33-39
• 3.4 高血糖增加小鼠眼部 BMCs 數(shù)量39-40
• 3.5 高血糖加重小鼠 CNV 嚴(yán)重程度40-43
• 3.6 高血糖影響小鼠眼部 VEGF 和 SDF-1 蛋白表達(dá)43-44
• 4. 討論44-48
• 小結(jié)48-49
• 參考文獻(xiàn)49-57
• 附錄57-58
• 個(gè)人簡歷和研究成果58-59
• 致謝59-60

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 李鶴一;王雨生;;活體光學(xué)成像技術(shù)在眼科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用前景[J];眼科新進(jìn)展;2011年06期

2 常遠(yuǎn);王雨生;曹豐;張健;蔡巖;李鶴一;侯慧媛;;在體生物發(fā)光成像術(shù)觀察骨髓來源細(xì)胞參與脈絡(luò)膜新生血管的形成[J];眼科新進(jìn)展;2013年05期

  本文關(guān)鍵詞：高血糖對(duì)骨髓來源細(xì)胞參與脈絡(luò)膜新生血管的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：285819