【摘要】：研究背景研究表明EB(Epstein-Barr)病毒感染與鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系。潛伏膜蛋白1(LMP1)是EB病毒主要的轉(zhuǎn)化基因產(chǎn)物,大多數(shù)EB病毒相關(guān)惡性腫瘤都伴有LMP1的異常表達(dá),LMP1不僅能促進(jìn)腫瘤的發(fā)病機(jī)理和疾病表型還能促進(jìn)靶細(xì)胞增殖和顛覆細(xì)胞死亡程序,LMP1在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)具有一定的特異性,作為病毒-宿主相互作用的重要因素,LMP1可能是臨床治療鼻咽癌潛在的靶標(biāo)。表觀遺傳過程與癌癥進(jìn)展密切相關(guān)。組蛋白的乙�；癄顟B(tài)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入DNA并影響基因表達(dá)水平。組蛋白去乙�；�(HDAC)可以降低組蛋白的乙�；�,使DNA和組蛋白的結(jié)合更緊密,從而阻斷基因轉(zhuǎn)錄。HDAC抑制劑能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖,誘導(dǎo)腫瘤的分化和凋亡,而對正常組織幾乎沒有影響。目前已有多種HDAC抑制劑被用于淋巴瘤的臨床治療,但在實(shí)體瘤鼻咽癌中卻鮮有研究報(bào)道,我們將在體內(nèi)外探究二代新型HDAC抑制劑Quisinostat(JNJ-26481585,JNJ)在鼻咽癌中的作用,為鼻咽癌的臨床治療提供新的選擇。研究方法1、通過RT-PCR實(shí)驗(yàn)研究EB病毒膜蛋白LMP1基因的表達(dá)量在臨床鼻咽癌患者癌和癌旁組織中是否具有差異性。2、在鼻咽癌CNE1細(xì)胞系中穩(wěn)定表達(dá)EB病毒的膜蛋白LMP1(CNE1-3G細(xì)胞為表達(dá)空載體的對照細(xì)胞,CNE1-3G-LMP1為過表達(dá)LMP1的穩(wěn)定細(xì)胞株)。通過免疫印記實(shí)驗(yàn)檢測LMP1在CNE1細(xì)胞中的表達(dá)效率。通過克隆形成實(shí)驗(yàn)以及Ki-67免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)研究過表達(dá)LMP1對CNE1細(xì)胞增殖能力的影響。3、通過MTT實(shí)驗(yàn)研究CNE1-3G和CNE1-3G-LMP1細(xì)胞對HDAC抑制劑JNJ的敏感性。通過免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量的變化以及Annexin V-FITC/PI雙染色法研究HDAC抑制劑JNJ對CNE1-3G和CNE1-3G-LMP1細(xì)胞凋亡的影響。4、通過裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)研究HDAC抑制劑JNJ能否在體內(nèi)選擇性作用于LMP1陽性的鼻咽癌細(xì)胞。將相同數(shù)量的CNE1-3G和CNE1-3G-LMP1細(xì)胞注射到裸鼠皮下(每組10只,雌雄各半),當(dāng)裸鼠出現(xiàn)皮下瘤時(shí),每周3次腹腔注射HDAC抑制劑JNJ,并記錄腫瘤的大小以及裸鼠的體重。研究結(jié)果1、EB病毒的膜蛋白LMP1促進(jìn)鼻咽癌CNE1細(xì)胞的增殖能力。CNE1-3G-LMP1細(xì)胞形成克隆的數(shù)量明顯多于CNE1-3G細(xì)胞;CNE1-3G-LMP1細(xì)胞Ki-67免疫熒光染色的陽性率明顯高于CNE1-3G細(xì)胞。2、HDAC抑制劑JNJ選擇性作用于CNE1-3G-LMP1細(xì)胞,并顯著性抑制CNE1-3G-LMP1細(xì)胞的增殖能力。HDAC抑制劑JNJ對LMP1陽性的CNE1-3G-LMP1和表達(dá)空載體的CNE1-3G細(xì)胞的半數(shù)抑制劑量(IC50)分別為0.4n M和23n M;CNE1-3GLMP1細(xì)胞經(jīng)過HDAC抑制劑JNJ處理后形成克隆的數(shù)目明顯減少;免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)顯示CNE1-3G-LMP1細(xì)胞經(jīng)過HDAC抑制劑JNJ處理后Ki-67染色的陽性率明顯降低。3、EB病毒的膜蛋白LMP1促進(jìn)鼻咽癌CNE1細(xì)胞的成瘤能力,HDAC抑制劑JNJ特異性的靶向LMP1陽性的鼻咽癌細(xì)胞。裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)顯示:(1)CNE1-3G-LMP1細(xì)胞的成瘤能力明顯強(qiáng)于CNE1-3G細(xì)胞;(2)腹腔注射HDAC抑制劑JNJ組CNE1-3G-LMP1細(xì)胞所成皮下瘤的數(shù)量和大小明顯小于注射PBS組CNE1-3G-LMP1細(xì)胞所成的皮下瘤;(3)腹腔注射HDAC抑制劑JNJ組CNE1-3G細(xì)胞所成皮下瘤的數(shù)量和大小與注射PBS組CNE1-3G細(xì)胞相比并無明顯差別。研究結(jié)論1、EB病毒的膜蛋白LMP1促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞系CNE1的增殖及成瘤能力。2、HDAC抑制劑JNJ能特異性的抑制LMP1陽性鼻咽癌CNE1細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。3、HDAC抑制劑JNJ在體內(nèi)能特異性的靶向LMP1陽性鼻咽癌CNE1細(xì)胞,抑制LMP1陽性鼻咽癌CNE1細(xì)胞的成瘤能力。
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R739.63
【圖文】：

圖 1：EB 病毒的膜蛋白 LMP1 促進(jìn)鼻咽癌 CNE1 細(xì)胞的增殖能力。A：特異性引物 PCR 后凝膠遷移實(shí)驗(yàn)檢測鼻咽癌組織和癌旁組織中 LMP1 的基因表達(dá)水平。2N，3N，23N 為癌旁組織；2T，3T，23T 為與其相對應(yīng)的鼻咽癌組織， GAPDH 為內(nèi)參基因。B：Dox 可誘導(dǎo) LMP1 過表達(dá)的 CNE1-3G-LMP1 細(xì)胞分別用如圖所示濃度的 Dox 處理 48 小時(shí)后，免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測 LMP1 的蛋白表達(dá)水平，GAPDH 作為內(nèi)參蛋白。C&D：CNE1-3G(3G)與可誘導(dǎo)過表達(dá) LMP1 的 CNE1-3G-LMP1（LMP1）的細(xì)胞分別做平板克隆實(shí)驗(yàn)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，* P< 0.05。E &F：CNE1-3G(3G)與可誘導(dǎo)過表達(dá) LMP1 的 CNE1-3G-LMP1（LMP1）的細(xì)胞做 Ki-67 染色實(shí)驗(yàn)并做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，** P< 0.01。

陽性率明顯高于表達(dá)空載體的 CNE1-3G 細(xì)胞，HDAC 抑制劑 JNJ 處理組 CNE1-3G-LMP1 細(xì)胞 Ki-67 的陽性率較 DMSO 處理組明顯下降，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而 JNJ處理組CNE1-3G細(xì)胞 Ki-67的陽性率與DMSO處理組并無明顯差別（如圖2D&E）。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們得出 HDAC 抑制劑 JNJ 能特異性靶向 LMP1 陽性的鼻咽癌細(xì)胞，并能選擇性抑制 LMP1 陽性的鼻咽癌細(xì)胞增殖能力。

圖 3： HDAC 抑制劑 JNJ 選擇性誘導(dǎo) LMP1 陽性鼻咽癌細(xì)胞凋亡A：CNE1-3G 和 CNE1-3G-LMP1 細(xì)胞 Dox 處理 24 小時(shí)后加濃度為 0.2μM 的 JNJ 處理 24 小時(shí)，免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)量，GAPDH 蛋白作為內(nèi)參蛋白。B： CNE1-3G 和 CNE1-3G-LMP1 細(xì)胞 Dox 誘導(dǎo) 24 小時(shí)后用濃度為 0.2μM 的 JNJ（DMSO 為對照）處理 24 小時(shí)，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的凋亡。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 梁賓勇;熊敏;紀(jì)桂寶;張二雷;張尊義;董可帥;陳孝平;黃志勇;;Synergistic Suppressive Effect of PARP-1 Inhibitor PJ34 and HDAC Inhibitor SAHA on Proliferation of Liver Cancer Cells[J];Journal of Huazhong University of Science and Technology(medical Sciences);2015年04期

2 張夏男;李躍綱;賈效偉;劉秉慈;葉萌;;p53在苯并[a]芘誘導(dǎo)所致p21和細(xì)胞周期蛋白改變中的作用[J];衛(wèi)生研究;2014年02期

本文編號：2798746