【摘要】：[目的]TON是目前外傷性損傷中導(dǎo)致視力下降的主要原因,主要表現(xiàn)為神經(jīng)組織水腫和微循環(huán)障礙。然而目前臨床上對TON治療沒有一種統(tǒng)一的診斷及處理標(biāo)準(zhǔn),如果治療不及時嚴(yán)重者可致盲。TON軸突改變主要是微管微絲的崩解致使神經(jīng)元進(jìn)一步凋亡的過程。近年來大量文獻(xiàn)報道微管相關(guān)蛋白——Tau蛋白,具有穩(wěn)定及促微管聚合功能,該功能主要通過Tau磷酸化水平進(jìn)行調(diào)節(jié)。Tau磷酸化一直被認(rèn)為是AD、PD等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機制之一。有文獻(xiàn)顯示在Tau轉(zhuǎn)基因小鼠中運用微管穩(wěn)定劑埃博霉素可改善小鼠認(rèn)知障礙、減少Tau病變。本課題首次將微管穩(wěn)定劑埃博霉素運用于視神經(jīng)夾持鑷建立大鼠外傷性視神經(jīng)病變模型中,研究TON后給予埃博霉素是否會出現(xiàn)視神經(jīng)軸突及視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的修復(fù)再生,觀察是否會出現(xiàn)視神經(jīng)傳導(dǎo)通路改善情況及Tau蛋白磷酸化改變情況。為TON的治療及其他神經(jīng)退行性疾病研究提供參考依據(jù)。[方法]采用50 g力度的視神經(jīng)夾持鑷建立大鼠視神經(jīng)夾持損傷模型;將94只成年SPF級雌性SD大鼠隨機分成埃博霉素治療組(n=12)和溶劑對照組(n=12)。實驗組給予埃博霉素腹腔注射1mg/kg,對照組給予同樣體積的溶劑DMSO腹腔注射,同時行左眼視神經(jīng)夾持損傷模型,右眼分離視神經(jīng),不行夾持。損傷后時間點分別在3D、7 D進(jìn)行取材,每個時間點共6只大鼠。Western blot實驗(n=3)觀察分別給予埃博霉素和DMSO后視網(wǎng)膜及視神經(jīng)在相應(yīng)時間點的Tau蛋白表達(dá)水平及磷酸化變化情況;采用免疫熒光組織化學(xué)染色法(n=3)觀察大鼠視神經(jīng)損傷后給藥及不給藥不同時間點視神經(jīng)軸突再生變化情況,及全視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGCs)的變化情況;并采用免疫熒染色方法(n=3)觀察視神經(jīng)微管變化及軸突再生共表達(dá)情況;同時埃博霉素治療組(n=10)建立大鼠FVEP檢測模型,分別在1D,28D時間點檢測FVEP變化。隨機分為TON后基礎(chǔ)Tau蛋白磷酸化變化數(shù)據(jù)組(n=30)及TON后不同時間點FVEP改變數(shù)據(jù)組(n=30),分別在1D,3D,7D,14D,28D進(jìn)行取材及FVEP數(shù)據(jù)采集,每個時間點6只,Western blot實驗(n=6)觀察損傷后的視網(wǎng)膜及視神經(jīng)在相應(yīng)時間點的Tau蛋白表達(dá)水平及磷酸化變化情況及不同時間點視神經(jīng)傳導(dǎo)通路變化情況。[結(jié)果]Western blot實驗顯示:TON后基礎(chǔ)Tau磷酸化改變情況:TON后視神經(jīng)Tau蛋白含量持續(xù)降低后恢復(fù)正常;TON后視神經(jīng)Tau蛋白396/404磷酸化含量變化情況與Tau蛋白含量的變化情況一致;TON后14D時視神經(jīng)Tau蛋白396/404位點磷酸化程度增加;TON后視網(wǎng)膜Tau蛋白含量迅速降低后增量表達(dá);TON后視網(wǎng)膜Tau蛋白404磷酸化含量變化情況與Tau蛋白含量的變化情況相同而396位點則不同;TON后視網(wǎng)膜Tau蛋白396/404位點的作用時空不同。TON后埃博霉素D治療Tau磷酸化改變情況:埃博霉素D治療TON后視神經(jīng)Tau蛋白含量持續(xù)降低;埃博霉素治療TON后視神經(jīng)Tau磷酸化水平增高;埃博霉素D治療TON后視網(wǎng)膜Tau蛋白含量增高;埃博霉素D治療TON后視網(wǎng)膜Tau-396磷酸化水持續(xù)增高,404磷酸化水平短暫增高后降低。采用免疫熒光組織化學(xué)染色法顯示:3D給藥組與溶劑對照組RGC改變比例差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),且7D給藥組與對溶劑照組RGC改變比例差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。TON溶劑對照組:TON損傷眼視神經(jīng)中夾持點附近出現(xiàn)細(xì)胞核增多現(xiàn)象,且增多的細(xì)胞核向夾持部位遠(yuǎn)端蔓延;神經(jīng)特異性的β-3 Tublin提示遠(yuǎn)離夾持部位同樣出現(xiàn)空洞,且殘存的β-3Tublin形態(tài)不規(guī)則,呈現(xiàn)出扭結(jié)狀;同時難以檢測到GAP43的表達(dá);視網(wǎng)膜中GAP43表達(dá)降低,難以與β-3 Tublin共定位;TON治療組:TON治療眼視神經(jīng)中夾持點附雖然同樣出現(xiàn)細(xì)胞核增多現(xiàn)象,但僅局限于夾持部位,未向夾持部位的遠(yuǎn)端蔓延,神經(jīng)特異性的β-3 Tublin染色夾持部位遠(yuǎn)端未發(fā)現(xiàn)空洞,存留的β-3 Tublin形態(tài)完整為與正常眼情況類似的條索狀;治療組中,在夾持損傷部位檢測到大量的GAP43表達(dá)。治視網(wǎng)膜GAP43和β-3 Tublin表達(dá)量均增加,共表達(dá)加強。視神經(jīng)軸突再生表達(dá)的GAP43表達(dá)模式存在兩種,即核定位表達(dá)及隨β-3 Tublin成纖維狀;與核定位的GAP43為星型膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá),通過將視神經(jīng)星型膠質(zhì)細(xì)胞與GAP43共染發(fā)現(xiàn),GAP43能夠與GFAP標(biāo)記的星型膠質(zhì)細(xì)胞共表達(dá),證實GAP43的部分來源為星型膠質(zhì)細(xì)胞羅蘭電生理顯示:假手術(shù)眼出現(xiàn)了典型的FEVP波形,表明僅暴露視神經(jīng)并不會影響FVEP的各項指標(biāo);手術(shù)眼FVEP出現(xiàn)明顯的波形改變,具體表現(xiàn)為N1波出現(xiàn)延遲,P1-N1波振幅縮減;手術(shù)眼相較于假手術(shù)眼其FVEPN1峰在各個測量時間點上均存在明顯的延遲(P0.01),平均延遲時間為14.34 ms;手術(shù)眼相較于假手術(shù)眼其FVEP P1-N1的振幅差在各個測量時間點上均顯著變小(P0.01),平均增幅縮減-40.30μs;TON損傷發(fā)展過程中,手術(shù)眼相較于假手術(shù)眼的FVEP P1-N1振幅縮減情況在不同時間點上沒有明顯的改善或加重現(xiàn)象,而N1延遲程度在3D-7D時期內(nèi)發(fā)生了輕微的自然緩解現(xiàn)象(P0.05)。TON后給予埃博霉素D治療后FVEP出現(xiàn)了視神經(jīng)傳導(dǎo)通路改善情況。[結(jié)論]1.大鼠TON造模后可致由FVEP檢測的視覺電信號傳導(dǎo)減緩且電信號傳導(dǎo)質(zhì)量降低,視神經(jīng)夾持后可導(dǎo)致視覺電信號傳導(dǎo)通路發(fā)生障礙。2.大鼠TON建模后可致視神經(jīng)中游離Tau蛋白含量降低且磷酸化水平增高;而視網(wǎng)膜中的RGC胞體在損傷后發(fā)生了持續(xù)的游離Tau消耗的過程且胞體內(nèi)Tau未檢測到發(fā)生廣泛的磷酸化現(xiàn)象。3.TON后給予埃博霉素D,視神經(jīng)傳導(dǎo)通路改善;4.TON后給予埃博霉素D抑制了視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡;TON后給予埃博霉素D,視神經(jīng)及視網(wǎng)膜均出現(xiàn)軸突再生現(xiàn)象;視神經(jīng)中指示再生的GAP43存在于細(xì)胞核附近且能夠與GFAP共定位,提供軸突生長的GAP43蛋白可能來源于星型膠質(zhì)細(xì)胞5.TON后給予微管穩(wěn)定劑埃博霉素D,視神經(jīng)游離Tau蛋白水平降低,視網(wǎng)膜中游離Tau蛋白水平增高;而兩部位的Tau-396/404位點的磷酸化水平均不同程度的得到增強。
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R779.1
【圖文】：

圖２邋Ｔａｕ蛋白磷酸化位點逡逑最早Ｔａｕ蛋白與疾病的相關(guān)性是來源于阿爾茲海默癥（ＡＤ）、帕金森（ＰＤ）等逡逑神經(jīng)退行性疾病研究中，顯示增高的Ｔａｕ磷酸化水平是直接的致病因素。Ｔａｕ蛋逡逑白調(diào)控微管穩(wěn)定性主要通過磷酸化和異構(gòu)化作用。當(dāng)Ｔａｕ蛋白被高度磷酸化后會逡逑誘導(dǎo)形成Ｔａｕ寡聚體，進(jìn)而損壞正常的微管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)［２４］。磷酸化通過改變Ｔａｕ逡逑蛋白特性，使正常的游離Ｔａｕ變成神經(jīng)纖維纏結(jié)－Ｔａｕ存在子損傷后的神經(jīng)元內(nèi)，逡逑結(jié)果導(dǎo)致Ｔａｕ結(jié)合和穩(wěn)定微管的能力下降，影響正常微管組裝過程，最終影響神逡逑經(jīng)元的細(xì)胞生物學(xué)功能。逡逑１４逡逑

等細(xì)胞關(guān)鍵生物學(xué)過程中的功能基礎(chǔ)。微管相關(guān)蛋白一￣Ｔａｕ蛋白，是影響微管逡逑穩(wěn)定性的重要分子。逡逑正常情況下，Ｔａｕ蛋白功能主要是被Ｔａｕ選擇性的磷酸化所調(diào)節(jié)的（如圖２逡逑所示）。Ｔａｕ蛋白結(jié)合微管蛋白并作為微管早期裝配的核心，促進(jìn)微管蛋白在此逡逑核心上延伸聚集形成微管。Ｔａｕ蛋白通過其Ｃ端的重復(fù)區(qū)域和微管結(jié)合，刺激微逡逑管的組裝，從而促進(jìn)微管成核、生長和成束，并顯著減少微管的動態(tài)不穩(wěn)定性逡逑［２５－２７］。有研宄表明，Ｔａｕ蛋白和軸漿運輸密切相關(guān)，Ｓｔａｍｅｒ等發(fā)現(xiàn)［２５］，過表達(dá)逡逑Ｔａｕ蛋白會抑制軸漿運輸，抑制線粒體、突出囊泡等細(xì)胞器在突觸中的分布。研逡逑究顯示Ｔａｕ蛋白的過量表達(dá)可導(dǎo)致微管（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅｓ，ＭＴｓ）的局部裂解及軸突交逡逑通阻滯，這將打亂ＭＴｓ的平行隊列，ＭＴｓ碎片失去它們的原本方向，便自由地逡逑朝各個方向散開而形成ＭＴｓ漩渦［２８］（如圖１）。這種不規(guī)整的微管網(wǎng)路可能是逡逑抑制神經(jīng)元軸漿運輸?shù)脑蛑�。在原代神�?jīng)元中對線粒體實時成像結(jié)果顯示

等細(xì)胞關(guān)鍵生物學(xué)過程中的功能基礎(chǔ)。微管相關(guān)蛋白一￣Ｔａｕ蛋白，是影響微管逡逑穩(wěn)定性的重要分子。逡逑正常情況下，Ｔａｕ蛋白功能主要是被Ｔａｕ選擇性的磷酸化所調(diào)節(jié)的（如圖２逡逑所示）。Ｔａｕ蛋白結(jié)合微管蛋白并作為微管早期裝配的核心，促進(jìn)微管蛋白在此逡逑核心上延伸聚集形成微管。Ｔａｕ蛋白通過其Ｃ端的重復(fù)區(qū)域和微管結(jié)合，刺激微逡逑管的組裝，從而促進(jìn)微管成核、生長和成束，并顯著減少微管的動態(tài)不穩(wěn)定性逡逑［２５－２７］。有研宄表明，Ｔａｕ蛋白和軸漿運輸密切相關(guān)，Ｓｔａｍｅｒ等發(fā)現(xiàn)［２５］，過表達(dá)逡逑Ｔａｕ蛋白會抑制軸漿運輸，抑制線粒體、突出囊泡等細(xì)胞器在突觸中的分布。研逡逑究顯示Ｔａｕ蛋白的過量表達(dá)可導(dǎo)致微管（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅｓ，ＭＴｓ）的局部裂解及軸突交逡逑通阻滯，這將打亂ＭＴｓ的平行隊列，ＭＴｓ碎片失去它們的原本方向，便自由地逡逑朝各個方向散開而形成ＭＴｓ漩渦［２８］（如圖１）。這種不規(guī)整的微管網(wǎng)路可能是逡逑抑制神經(jīng)元軸漿運輸?shù)脑蛑弧Ｔ谠窠?jīng)元中對線粒體實時成像結(jié)果顯示

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

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2 李燦,王一;睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子對大鼠視神經(jīng)不全損傷后軸漿運輸?shù)挠绊慬J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2004年05期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

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本文編號：2781880