【摘要】：研究背景： 甲狀腺相關(guān)性眼�。═hyroid associated Ophthalmopathy，TAO）是最常見的眼眶疾病，在歐美國家中，TAO的發(fā)病率男、女分別為16/10萬和3/10萬，目前國內(nèi)的發(fā)病率尚無明確數(shù)據(jù)，但據(jù)國內(nèi)的一些城市的流行病學(xué)調(diào)查表明，隨我國食鹽中含碘量的增加，甲狀腺功能亢進(jìn)(簡稱甲亢)發(fā)病率出現(xiàn)上升趨勢，而甲亢是導(dǎo)致TAO最主要的因素，其中大約25% 50%的甲亢患者會出現(xiàn)TAO。由此可見，TAO的發(fā)病率也有逐年增高。TAO是一組非常復(fù)雜的眼眶病，輕者可以導(dǎo)致眼球突出、眼瞼閉合不全，從而影響患者外觀；重者可以導(dǎo)致復(fù)視、視力下降甚至失明。然而TAO的病因尚不明確，其主要治療方案目前也只是局限于對癥治療，如激素沖擊療法、復(fù)視矯正術(shù)、提上瞼肌延長術(shù)和眼眶減壓術(shù)等。況且大部分患者以眼球突出就診，就診時往往已經(jīng)有很明顯的眼部癥狀，常規(guī)給予激素沖擊治療的完全治愈率幾乎為0%，治療后易出現(xiàn)反復(fù)復(fù)發(fā)，這些都嚴(yán)重的影響了TAO患者的生活質(zhì)量。 自Wilson首次發(fā)現(xiàn)在Grave’s病患者中有氧化自由基的活性增加以及抗氧化活性的減少以來，氧化應(yīng)激開始進(jìn)入Grave’s病研究者的視野中，氧化應(yīng)激是指體內(nèi)氧化與抗氧化作用的失衡，傾向于氧化。目前越來越多的基礎(chǔ)和臨床研究證據(jù)證明氧化應(yīng)激的代謝參與了甲狀腺相關(guān)眼病的自身免疫的病理發(fā)病過程。因此，人們開始探索安全有效的甲狀腺相關(guān)眼病的抗氧化治療方法，但目前抗氧化治療方面的研究較少，抗氧化藥物也多為口服，作用緩慢。最近一些氧化應(yīng)激參與的疾病如阿爾茨海默病、糖尿病、動脈樣硬化等疾病的研究中發(fā)現(xiàn)，17 β雌二醇能有效抑制相關(guān)疾病中的氧化應(yīng)激水平，且副作用小，可局部注射或經(jīng)皮局部給藥。因此我們則致力于探索17 β雌二醇在甲狀腺相關(guān)眼病成纖維細(xì)胞中氧化應(yīng)激損傷方面的作用，希望能為甲狀腺相關(guān)眼病探索出一條安全、有效、易普及的抗氧化治療方案。 本課題擬采用過氧化氫(H2O2)作用于甲狀腺相關(guān)性眼病患者眼外肌來源成纖維細(xì)胞(orbital fibroblasts，OF)，制備外源性氧化應(yīng)激細(xì)胞模型，探索17β-雌二醇（E2）在TAO成纖維細(xì)胞氧化應(yīng)激過程中的保護作用。實驗共分為兩部分：第一部分，建立TAO成纖維細(xì)胞外源性氧化應(yīng)激細(xì)胞模型，利用MTT法明確干預(yù)成纖維細(xì)胞的H2O2的濃度，并且明確17-β雌二醇的對TAO成纖維細(xì)胞增殖是否有影響，為后期17-β雌二醇干預(yù)后氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的檢測做準(zhǔn)備；第二部分，研究不同濃度的17-β雌二醇干預(yù)成纖維細(xì)胞外源性氧化應(yīng)激細(xì)胞模型后抗氧化酶CAT、SOD、GSH/GSSH和脂質(zhì)氧化損傷產(chǎn)物MDA的水平，分析17-β雌二醇的濃度與抗氧化酶CAT、SOD、GSH/GSSH和脂質(zhì)氧化損傷產(chǎn)物MDA的水平的關(guān)系。 第一部分：TAO成纖維細(xì)胞外源性氧化應(yīng)激細(xì)胞模型的建立 目的:采用H2O2干預(yù)TAO成纖維細(xì)胞，建立TAO成纖維細(xì)胞的外源性氧化應(yīng)激細(xì)胞模型，為下一步不同濃度17-β雌二醇的干預(yù)此細(xì)胞模型后CAT、SOD、GSH/GSSH和脂質(zhì)氧化損傷產(chǎn)物MDA的檢測做準(zhǔn)備。 方法：眼眶成纖維細(xì)胞培養(yǎng)來源于TAO限制性斜視矯正術(shù)及嚴(yán)重性TAO行眼眶減壓術(shù)取下的眼外肌，采用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)TAO眼眶成纖維細(xì)胞，采用MTT法確定TAO成纖維細(xì)胞亞致死劑量的H2O2濃度作為TAO成纖維細(xì)胞的干預(yù)濃度。此外，繼續(xù)采用MTT法觀察17-β雌二醇對TAO成纖維細(xì)胞增殖的影響。 結(jié)果：（1）數(shù)據(jù)被表示為四個獨立實驗的結(jié)果的平均值±SD。H2O2干預(yù)組與空白對照組的細(xì)胞成活率在H2O2濃度為60μmol/L的差異是有統(tǒng)計學(xué)意義的（76.8%，P=0.003＜0.05），而在40μmol/L時無明顯差異（87.4％，P=0.104）。（2）17-β雌二醇干預(yù)24h后，結(jié)果顯示17-β雌二醇干預(yù)組與空白組在細(xì)胞數(shù)量上無明顯差異。結(jié)論：（1）將40μmol/L作為制備外源性氧化細(xì)胞模型H2O2的干預(yù)濃度。（2）17-β雌二醇干預(yù)24h對TAO成纖維細(xì)胞的增殖無明顯影響。 第二部分：不同濃度的17-β雌二醇干預(yù)成纖維細(xì)胞外源性氧化應(yīng)激細(xì)胞模型后抗氧化酶CAT、SOD、GSH/GSSH和脂質(zhì)氧化損傷產(chǎn)物MDA的水平的檢測 目的:研究不同濃度的17-β雌二醇干預(yù)外源性氧化應(yīng)激細(xì)胞模型后，檢測其抗氧化酶CAT、SOD、GSH/GSSH和脂質(zhì)氧化損傷產(chǎn)物MDA的水平，以明確17-β雌二醇的抗氧化作用。 方法：將TAO患者來源的成纖維細(xì)胞隨機分為6組培養(yǎng):A組(空白組：無17-β雌二醇、無H2O2)、B組(單純40μmol/L H2O2刺激組)、C組(40μmol/L H2O2+2.5nmol/L17-β雌二醇)、D組(40μmol/L H2O2+5nmol/L17-β雌二醇)及E組（40μmol/L H2O2+10nmol/L17-β雌二醇）。17-β雌二醇干預(yù)組在加入H2O2前先加入17-β雌二醇預(yù)處理，并放于含體積分?jǐn)?shù)5%CO2細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱孵育24h，之后H2O2干預(yù)90min后，檢測各組過氧化氫酶（CAT）和超氧化岐物酶（SOD）的活性、丙二醛(MDA)以及谷胱甘肽(GSH)/氧化型谷胱甘肽(GSSG)的水平。 結(jié)果：（1）17-β雌二醇對TAO成纖維細(xì)胞氧化應(yīng)激過程中抗氧化體系（SOD、CAT和GSH/GSSH）的影響：H2O2處理1.5h后,除了C組的GSH/GSSH，17-β雌二醇預(yù)處理組（C、D、E組）與單純H2O2組（B組）在SOD、CAT、GSH/GSSH和MDA水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)，且隨著17-β雌二醇濃度的增加，各抗氧化酶活性也隨之增加。而17-β雌二醇干預(yù)組（C、D、E組）與空白對照組（A組）在SOD、CAT、GSH/GSSH和MDA水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；（2）17-β雌二醇對TAO成纖維細(xì)胞氧化應(yīng)激過程中脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA的影響：H2O2干預(yù)后，各組的MDA含量較空白對照組均顯著增多（P＜0.05），且隨著預(yù)干預(yù)的17β雌二醇的濃度越小，MDA的含量越高，單純H2O2干預(yù)組的MDA含量最高，且與17-β雌二醇干預(yù)的各組的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論：1、雌二醇干預(yù)組的抗氧化酶類均比無雌二醇干預(yù)組高，且與17-β雌二醇的濃度呈正相關(guān)； 2、雌二醇干預(yù)組的脂質(zhì)氧化反應(yīng)產(chǎn)物MDA較無雌二醇干預(yù)組低，且與17-β雌二醇的濃度成負(fù)相關(guān)。 總之，17-β雌二醇可明顯增高TAO成纖維細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的水平，從而增強其對外源性氧化應(yīng)激的抗氧化能力，減輕其氧化損傷，且成劑量相關(guān)性。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R771.3
【圖文】：

原型谷胱甘肽(GSH)和氧化谷胱甘肽(GSSG)的檢測。發(fā)現(xiàn)TAO成纖維細(xì)胞較健康人的成纖維細(xì)胞對氧化應(yīng)激的反應(yīng)更為敏感，這有可能是因為抗氧化酶譜的減少甚至耗竭所致（見圖1）。由此可得出，假如我們找到有效的治療措施能夠終止氧化應(yīng)激對TAO成纖維細(xì)胞的損傷，則有可能對緩解TAO的癥狀有著巨大的意義。圖 1 氧化應(yīng)激酶類在氧化應(yīng)激過程中的作用及變化示意圖目前 TAO 的抗氧化治療研究較少，Bouzas 進(jìn)行了一項小例數(shù)試驗，使用別嘌呤醇和尼克酰胺對 TAO 患者進(jìn)行抗氧化治療，顯示其對輕度和中度 TAO 有非常好的效果，無副作用，且患者滿意度較高[15]。此外，最近歐洲進(jìn)行了一項大型臨床試驗，給予輕到重度的 TAO 患者硒治療

圖 2 可見細(xì)胞生長融合，倒置相差顯微鏡×10 MTT 法確定亞致死劑量的 H2O2濃度(即外源性氧化應(yīng)激細(xì)模型中 H2O2的干預(yù)濃度)實驗以 MTT 法檢測細(xì)胞活性，細(xì)胞 MTT 還原率(OD492值)越高，反映細(xì)胞盛、活力越強，以 0μmol/LH2O2組成纖維細(xì)胞的細(xì)胞存活率為 100％，計成纖維細(xì)胞的存活率。不同濃度 H2O2干預(yù) TAO 眼眶成纖維細(xì)胞 90min 后，細(xì)胞的吸光值(OD 值)及計算出的細(xì)胞成活率分別見圖 3 和表 1。應(yīng)用單因素，可得出結(jié)果：H2O2干預(yù)組與空白對照組的細(xì)胞成活率在 H2O2濃度為 60μmo是有統(tǒng)計學(xué)意義的（76.8%，P = 0.003＜0.05），而在 40μmol/L 時差異無義（87.4％，P =0.104）（見圖 1）�；谶@些結(jié)果，認(rèn)定 40μmol/L 為 H2O 眼眶成纖維細(xì)胞的亞致死劑量，即作為下面的實驗外源性氧化應(yīng)激細(xì)胞模型

【參考文獻(xiàn)】

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1 雷少波;唐羅生;朱曉華;段宣初;;雌激素對藍(lán)光及過氧化氫誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞內(nèi)活性氧生成的影響[J];國際眼科雜志;2008年06期

本文編號：2744676