【摘要】：聽力損失或耳聾(hearing loss)是一種常見的耳鼻咽喉科疾病。2013年世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計顯示全球已有高達3.6億聽力殘障人士。耳聾患者通常伴有不同程度的耳鳴、眩暈、失眠、焦慮、抑郁,甚至恐懼和外人交流,導(dǎo)致患者生理和心理都面臨相當(dāng)大地痛苦,生活質(zhì)量明顯下降,因而如何預(yù)防和治療聽力損失或耳聾已成為全球關(guān)注的公共健康問題。病因?qū)W研究認為耳聾可由遺傳、感染、藥物、噪音、創(chuàng)傷、衰老以及自身免疫等因素誘發(fā)。其中,自身免疫性內(nèi)耳病(Autoimmune inner ear disease,AIED)是少數(shù)進展迅速,但經(jīng)及時、恰當(dāng)治療后可部分或全部逆轉(zhuǎn)的病因之一。因此,探究AIED發(fā)病機制以及探尋如何及時診斷并有效治療AIED具有重要的臨床意義。近年研究認為內(nèi)淋巴囊(endolymphatic sac,ES)是內(nèi)耳的組成性免疫防御系統(tǒng)。當(dāng)內(nèi)耳受抗原刺激后,ES部位的免疫活性細胞一方面通過增殖分化大量增加,另一方面通過釋放的炎癥介質(zhì)介導(dǎo)全身血流循環(huán)中炎癥細胞的招募,進而放大ES的免疫作用,完成抗原捕捉、吞噬和清除過程。若持續(xù)且過于強烈的免疫應(yīng)答反應(yīng)發(fā)生,則可引發(fā)耳蝸組織發(fā)生一些病理性改變,最終導(dǎo)致AIED形成。由此提示,靶向ES的免疫或炎癥相關(guān)基因可能是治療AIED的潛在途徑。但目前關(guān)于ES中參與免疫或炎癥的基因仍知之甚少。由于無法進行活體內(nèi)耳組織檢查,目前AIED診斷主要通過臨床癥狀、實驗室檢查以及影像學(xué)檢查進行綜合判斷。其中,血液檢測是最主要的手段,包括特異性抗原(如HSP-70)、免疫相關(guān)的細胞(如淋巴細胞)以及分泌的細胞因子(如TNF)。盡管如此,目前臨床上用于診斷AIED的標志物仍然有限,需進一步探尋。miRNAs是一類分子大小約為22個核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA,其通過轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的表達,從而參與調(diào)控疾病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后。因此,調(diào)控免疫或者炎癥因子的miRNA可能是潛在的診斷AIED的分子標志物。目前已有文獻探討了 miRNAs對自身免疫性甲狀腺疾病以及自身免疫性胰腺炎的診斷性能,但關(guān)于AIED相關(guān)的miRNAs還少見報道�；谀壳按嬖诘膯栴},本論文擬主要開展了以下三個方面的工作:第一部分:研究目的:利用ES轉(zhuǎn)錄組芯片數(shù)據(jù)篩選炎癥相關(guān)的基因,為AIED治療提供潛在的靶點。研究方法:從公共數(shù)據(jù)庫歐洲生物信息研究所下載E-MEXP-3022數(shù)據(jù),此數(shù)據(jù)包含6個大鼠樣本,即3個ES樣本以及3個純的ES旁硬腦膜組織。利于RMA(Robust Multichip Average)算法進行原始數(shù)據(jù)的預(yù)處理;運用微陣列數(shù)據(jù)法線性模型(linear model for microarray data methods,LIMMA)篩選樣本間的差異表達基因(differentially expressed genes,DEGs)。閾值設(shè)定為P值0.05且丨log2FC|1;使用DAVID在線工具分別預(yù)測上調(diào)和下調(diào)基因可能參與的功能(gene ontology,GO)和信號通路(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG);使用 STRING 數(shù)據(jù)庫預(yù)測分析 DEGs 編碼的蛋白質(zhì)之間的互作關(guān)系,采用Cytoscape軟件進行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建,隨后采用CytoNCA插件計算蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點的拓撲學(xué)特征(包括節(jié)點的度、介數(shù)中心性以及子圖中心性)以篩選網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因;采用Cytoscape軟件的ClusterONE插件挖掘PPI網(wǎng)絡(luò)中存在的功能相關(guān)且基因之間緊密聯(lián)系的模塊,隨后對每個子網(wǎng)絡(luò)同樣進行功能富集分析;為了從多角度和多物種水平確認基因的重要性,我們將從大鼠篩選到的DEGs與2015年M(?)ller等鑒定的人的ES組織炎癥,免疫相關(guān)基因取交集,以獲得共同的基因。研究結(jié)果:根據(jù)設(shè)定的閾值,我們發(fā)現(xiàn)ES和對照組織之間有612個基因表現(xiàn)差異表達,包括396個上調(diào)和216個下調(diào)基因。功能富集分析結(jié)果表明上調(diào)DEGs富集到116個顯著的GO條目,包括細胞粘附GO:0007155-cell adhesion(富集的基因包含Itgal 和 Spp1);T 細胞協(xié)同刺激 GO:0031295-T cell co-stimulation(富集的基因包含Cc121和Cc119);細胞因子IL-1應(yīng)答GO:0070555-response to IL-1(富集的基因包含Cc121和Cc19),而下調(diào)DEGs富集到77個顯著的GO條目,同樣主要參與細胞粘附(GO:0007155～cell adhesion,富集的基因包含Tgfbi),炎癥性Toll受體信號通路(GO:0002224～toll-like receptor signaling pathway,富集的基因包含 Tlr2,Tlr7,Tlr8)以及陽性調(diào)節(jié) NF-kB 入核(GO:0042346～positive regulation of NF-kappaB import into nucleus,富集的基因包含Tlr2和Tlr7)。上調(diào)DEGs富集到6個顯著的KEGG通路,包括緊密連接(rno04530:Tight junction,富集基因包括 Cldn4),ECM 受體互作(rno04512:ECM-receptor interaction,富集基因包括Itgal和Sppl),白細胞跨內(nèi)皮轉(zhuǎn)移(rno04670:Leukocyte transendothelial migration,富集基因包括 Cldn4),而下調(diào)基因富集到7個KEGG通路,包括炎癥相關(guān)的疾病通路,如瘧疾(rno05144:Malaria,富集的基因包含Tgfb3和Tlr2)。將所有的差異基因映射到從STRING數(shù)據(jù)庫獲得的蛋白互作關(guān)系對,結(jié)果構(gòu)建成一個包含338個節(jié)點和777個PPI對的PPI網(wǎng)絡(luò)。隨后通過計算三種拓撲學(xué)特征,發(fā)現(xiàn)Itgal和Spp1是潛在重要的基因。采用ClusterONE方法從PPI網(wǎng)絡(luò)中提取出5個顯著的、蛋白之間緊密關(guān)的子網(wǎng)絡(luò)。其中模塊1和模塊2顯著富集到炎癥(包含Ccl21和Ccl19基因)以及細胞粘附(包括Cldn4基因)相關(guān)的通路。通過和2015年M(?)ller等的研究炎癥基因取交集,結(jié)果獲得了 6個共同的基因,包括Tlr7,Tlr2,Tlr8,Lpo,Gzmm以及Mucl。功能分析證明Tlr7,Tlr2,Tlr8和Gzmm富集到免疫相關(guān)的通路。研究結(jié)論及意義:ES 組織中 Itga1、Spp1、Ccl21、Ccl19、Cldn4、Tlr7、Tlr2 以及Tlr8的異常表達可能是AIED發(fā)生的潛在機制。第二部分:研究目的:采用miRNA二代測序技術(shù)鑒定與AIED顯著相關(guān)的生物標志物。研究方法:提取豚鼠內(nèi)耳膜組織制備內(nèi)耳抗原,隨后與同體積的完全弗氏佐劑混合,頸背部皮下多點注射構(gòu)建AIED模型。于免疫一周和兩周后分別選取部分豚鼠處死以采用病理組織學(xué)分析判斷模型的成功性。收集3只成功建模的AIED鼠和對照正常鼠的血清樣本進行miRNA深度測序。采用FastQC軟件對原始Fastq文件數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制,去除接頭序列以及低質(zhì)量的序列;采用miRDeep2對的miRNA數(shù)據(jù)定性,定量和歸一化,隨后采用Student's進行差異表達miRNAs的篩選。差異表達miRNA閩值設(shè)定為:p0.05;差異倍數(shù)1.5或1/1.5;表達均值log2(5RPM);采用TargetScan(物種選為Mouse)算法進行鼠源差異表達miRNA的靶基因預(yù)測,miRNA-靶基因互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)采用Cytoscape軟件進行展示;采用clusterProfiler對網(wǎng)絡(luò)基因進行GO和KEGG通路富集分析。研究結(jié)果:病理學(xué)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)免疫1周后,豚鼠蝸軸出現(xiàn)少量炎性細胞(主要是淋巴細胞)浸潤;螺旋神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量明顯減少,排列稀疏紊亂;Cortis器皺縮,偶有內(nèi)、外毛細胞缺失、壞死;可見少量壺腹嵴毛細胞空泡變性。說明AIED模型已構(gòu)建成功,隨后采用免疫一周的樣本進行miRNA表達譜分析。根據(jù)設(shè)定的閾值,在兩組樣本之間共檢測到22個差異表達miRNA,包括10個上調(diào)表達和12個下調(diào)表達。利用TargetScan軟件,我們?yōu)?2個差異表達的miRNA預(yù)測到1958個潛在的靶基因。隨后利用它們之間的互作構(gòu)建了 miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò),其包含22個miRNAs和1696個靶基因。采用clusterProfiler對差異miRNA的靶基因進行功能分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)分別有8個miRNA的靶基因富集到GO條目(miR-10b-3p,let-7j,miR-1943-5p,miR-196b-5p,miR-338-3p,miR-455-5p,miR-8112,miR-92b-3p)和 KEGG 通路(miR-10b-3p,let-7c-5p,let-7g-5p,let-7j,miR-181c-5p,miR-181d-5p,miR-222-3p,miR-8112)。其中三個miRNAs的靶基因在GO和KEGG通路分析時都富集到,包括miR-10b-3p,let-7j以及miR-8112。其中,miR-10b-3p主要通過調(diào)控炎性趨化因子(如Ccl12)來參與AIED;miR-8112主要通過靶向影響Wnt信號通路基因,包括Wnt9b,wnt 3a,Wnt2b;let-7j的靶基因主要參與鞘糖脂合成以及黏蛋白型O-聚糖的合成,如Galnt2。研究結(jié)論及意義:血清miR-10b-3p、miR-8112以及l(fā)et-7j可能是潛在的診斷AIED的生物標記物。它們主要通過參與調(diào)控炎癥相關(guān)靶基因來預(yù)測AIED的發(fā)病。第三部分:研究目的:整合分析ES組織轉(zhuǎn)錄組和血清miRNA表達譜數(shù)據(jù)以獲得調(diào)控ES的miRNAs,為臨床診斷和治療提供靶點。研究方法:采用Venn圖對比分析大鼠ES組織中篩選的612差異基因和小鼠血清中篩選的差異miRNA的1958個靶基因,獲得它們之間共同的基因。使用在線DAVID工具分別以大鼠和小鼠為物種預(yù)測共同基因參與的功能,包括GO和KEGG信號通路途。P0.05被視為顯著富集結(jié)果。研究結(jié)果:韋恩圖結(jié)果顯示大鼠ES組織中篩選的612差異基因和小鼠血清中篩選的差異miRNA的1958個靶基因之間有44個是共同的。采用大鼠作為物種,DAVID富集分析證明上述44個基因可參與10個GO條目,而采用小鼠作為物種,則可獲得13個GO條目。其中兩個物種分析都獲得可以參與細胞粘附的細胞外基質(zhì)相關(guān)的 GO 條目,包括 G0:0005578～proteinaceous extracellular matrix 和GO:0031012～extracellular matrix。富集到的基因包含 SBSPON、VWF、WNT16、ADAMTS8、SFRP1、LAMC2、ADAMTS12、PLSCR1。這些基因依次分別受到miR-1943-3p、miR-532-3p、let-7g-5p、miR-340-3p、miR-874-3p 以及 miR-511-3p 的調(diào)控。其中miR-511-3p和其靶點基因ADAMTS12的表達方向是相反,間接證明它們之間的負調(diào)控關(guān)系。此外,以大鼠為物種還發(fā)現(xiàn)共同基因可與富集到T細胞協(xié)同刺激的GO條目GO:0031295～T cell costimulation,證明這些富集的基因(EFNB3,DPP4)是參與AIED發(fā)生發(fā)展的重要靶點。EFNB3可受到miR-1943-5p的調(diào)控,而DPP4受miR-196-5p的調(diào)節(jié),且這兩組miRNA-mRNA之間的表達都是負相關(guān)的。研究結(jié)論及意義:miR-511-3p-ADAMTS12,miR-1943-5p-EFNB3 以及 miR-196-5p-DPP4互作對通過參與細胞外基質(zhì)粘附和T細胞協(xié)同刺激來促進AIED的發(fā)生,因此它們可能是AIED診斷和治療的潛在靶點。
【圖文】：

因表現(xiàn)出差異表達，包括３９６個上調(diào)基因和２１６個下調(diào)基因（表２．１）。熱圖分析表逡逑明所鑒定的ＤＥＧｓ可以明顯的將ＥＳ和對照組區(qū)分開來，，證明了邋ＤＥＧｓ的有效性。差異表逡逑達基因的ｈｅａｔｍａｐ圖見圖１，可以將樣本正確的分為兩類（圖２．邋１）。逡逑３０逡逑

圖２．２邋ＰＰＩ網(wǎng)絡(luò)
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R764.3

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本文編號：2707863