發(fā)布時(shí)間：2020-04-25 02:14

【摘要】：角膜新生血管(Corneal neovascularization,CoNV)可由缺氧、炎癥等多種因素刺激形成,嚴(yán)重危害患者視力。其中,血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)水平的提高是CoNV生成的關(guān)鍵。因此,抑制VEGF的表達(dá)對(duì)于治療該疾病具有重要作用。人參皂苷Rh2(Ginsenoside Rh2,GRh2)是從名貴藥材人參中提取的活性很高的藥物成分。既往研究證實(shí)GRh2具有顯著的抗癌活性,但其能否抑制VEGF誘導(dǎo)的CoNV尚未有研究報(bào)道。目的:本研究旨在探討GRh2對(duì)VEGF誘導(dǎo)的CoNV的抑制作用及相關(guān)機(jī)制。方法:(1)采用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)作為研究對(duì)象進(jìn)行體外培養(yǎng),給予不同濃度GRh2(0.25-250μM)處理細(xì)胞,(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞活性。細(xì)胞先給予1μM、10μM GRh2預(yù)處理30分鐘,隨后予VEGF(10ng/mL),MTT法、BrdU摻入實(shí)驗(yàn)、[H~3]胸苷摻入實(shí)驗(yàn)和Ki-67免疫熒光染色檢測(cè)細(xì)胞增殖能力;劃痕試驗(yàn)和遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力;成管實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞成管能力。(2)選取HUVECs細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),給予相關(guān)刺激后,Western Blot法檢測(cè)GRh2對(duì)VEGFR2信號(hào)通路和其下游ERK-MAPK和PI3K-AKT信號(hào)通路中相關(guān)蛋白表達(dá)的影響;免疫共沉淀(Co-IP)法檢測(cè)檢測(cè)GRh2對(duì)VEGFR2-Gab1結(jié)合及Gab1-p85結(jié)合、Gab1-SHP2結(jié)合的影響;檢測(cè)GRh2對(duì)銜接蛋白(Gab1,SHP2和p85)表達(dá)的影響。(3)選取HUVECs細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),短發(fā)夾RNA(shRNA)慢病毒載體敲低HUVECs中銜接蛋白Gab1的表達(dá),隨后給予VEGF刺激,Western Blot法檢測(cè)ERK-MAPK和PI3K-AKT信號(hào)通路中相關(guān)蛋白表達(dá)的改變;MTT法、BrdU ELISA分析和遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Gab1的敲低對(duì)細(xì)胞增殖和遷移的影響。(4)構(gòu)建堿燒傷小鼠模型,予以GRh2滴眼液治療,通過顯微裂隙燈觀察各組小鼠角膜新生血管生長(zhǎng)情況;HE染色法觀察角膜組織中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和新生血管生長(zhǎng)情況;qRT-PCR檢測(cè)各組小鼠角膜中IL-1β、IL-6、TNF-α、VEGF、MPP-9等mRNA表達(dá)情況。結(jié)果:(1)在體外,GRh2明顯抑制了VEGF誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞的增殖、遷移和成管。(2)GRh2明顯抑制了ERK-MAPK和PI3K-AKT信號(hào)通路中相關(guān)蛋白的磷酸化,并通過抑制VEGFR2與下游銜接蛋白Gab1等蛋白的結(jié)合抑制了VEGF信號(hào)通路。(3)干擾HUVECs中Gab1的表達(dá)明顯抑制了ERK-MAPK和PI3K-AKT信號(hào)通路中相關(guān)蛋白的磷酸化,抑制了VEGF誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖和遷移。干擾Gab1表達(dá)的HUVECs,加入GRh2不能進(jìn)一步抑制其增殖和遷移。(4)GRh2明顯抑制了堿燒傷小鼠角膜中炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)和新生血管的生成,抑制了小鼠角膜中IL-1β、IL-6、TNF-α、VEGF、MPP-9和LncRNA NR_033585等mRNA的表達(dá),促進(jìn)了PEDF和LncRNA chr8:129102060-129109035反向鏈等mRNA的表達(dá)。結(jié)論:GRh2可通過調(diào)控ERK-MAPK和PI3K-AKT信號(hào)通路的活化,從而調(diào)節(jié)HUVECs的功能,進(jìn)而抑制角膜新生血管的生成。GRh2有望成為治療角膜新生血管的新型藥物。
【圖文】：

但當(dāng) GRh2 的濃度在 125μM 以上時(shí)即可導(dǎo)致 MTTOD 的顯著下降（圖1）。這一結(jié)果提示，除非在極高的濃度下（125 μM 以上），GRh2 對(duì) HUVECs 沒有細(xì)胞毒性（圖 1）。圖 1 一定濃度下，GRh2 對(duì) HUVECs 無細(xì)胞毒性HUVECs 細(xì)胞用不同濃度 GRh2（0.25 至 250 μM）預(yù)處理 48 h，通過 MTT 法測(cè)定 GRh2 對(duì) HUVECs 細(xì)胞活力的影響。（“C”代表未經(jīng)處理的對(duì)照組，與“C”相比，*P <0.05；結(jié)果表示為平均值 ±SD，，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)四次。）其次，我們用 VEGF（10ng/mL）預(yù)處理細(xì)胞 24h

GRh2 抑制 VEGF 誘導(dǎo)的 HUVECs 細(xì)胞10 μM）預(yù)處理 30 min 后再予 VEGF（10ng / mL），培養(yǎng)胞活力的影響。（“C”代表未經(jīng)處理的對(duì)照組，與“C”相比有實(shí)驗(yàn)重復(fù)四次。）的 HUVECs 細(xì)胞增殖能力的影響LISA 實(shí)驗(yàn)和 Ki67 免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)VECs 細(xì)胞增殖顯著增加（圖 3，圖 4 A-B顯著降低了 HUVECs 的細(xì)胞增殖（圖 3，圖測(cè)細(xì)胞增殖的另一個(gè)指標(biāo)[47]，在此實(shí)驗(yàn) 摻入被 GRh2 顯著抑制（圖 5）。GRh2 對(duì) HUVECs 細(xì)胞增殖的抑制是呈劑增殖的抑制作用明顯優(yōu)于 1μM（圖 2，圖 3實(shí)，GRh2 在體外具有抑制 VEGF 誘導(dǎo)的
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R772.2

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本文編號(hào)：2639671