【摘要】：前言:喉癌是常見的惡性腫瘤之一,其中以鱗狀細胞癌最常見。喉癌的病因復(fù)雜,與吸煙、飲酒、暴露于有害的塵埃有關(guān)。盡管手術(shù)、化療、放療和免疫治療等多種治療技術(shù)不斷進步,但在過去的10年中患者的5年總生存率并沒有明顯改善。因此,尋找喉癌初期診斷與個體化治療的新型分子標志物是目前研究的熱點。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類長18~24個核苷酸的非編碼小RNA,具有重要的分子生物學(xué)功能。研究發(fā)現(xiàn),miRNA參與調(diào)節(jié)細胞的存活、自噬、增殖、凋亡以及遷移等重要生命過程。miRNA存在于人體多種體液中,在多種人類腫瘤中表達異常,參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展,是目前極具價值的包括腫瘤在內(nèi)的分子標志物。miR-181a是miR-181家族成員之一,可通過調(diào)控多種靶基因的表達,影響腫瘤細胞的增殖、粘附、侵襲和分化。研究證實,miR-181a在膠質(zhì)瘤、宮頸癌、肺癌和乳腺癌中發(fā)揮“抑癌基因”作用,而在肝癌和胃癌中發(fā)揮“癌基因”作用。目前,miR-181a在喉癌中相關(guān)研究未見報道。通過MiRanda等軟件預(yù)測,我們發(fā)現(xiàn)NPM1是miR-181a潛在靶標之一。近年來,對NPM1的研究主要集中在其與血液系統(tǒng)腫瘤的關(guān)系。此外,NPM1在包括前列腺癌、肝癌、肺癌等一些實體腫瘤中高表達,提示其在腫瘤中發(fā)揮癌基因作用。然而,NPM1在喉癌中相關(guān)研究亦未見報道。本研究應(yīng)用相關(guān)分子生物學(xué)技術(shù)檢測了miR-181a和NPM1在喉癌中的表達水平,鑒定了miR-181a的靶基因NPM1,并檢測了二者在喉癌中分子生物學(xué)功能,為進一步探討miR-181a在喉癌中的分子作用機制和作為喉癌分子標志物的可能性奠定了基礎(chǔ)。材料與方法:1、細胞系和組織標本:人喉癌細胞系Hep2、人胚腎細胞系HEK293T、喉癌組織標本。2、實驗方法:細胞培養(yǎng)、基因片段轉(zhuǎn)染實驗、qRT-PCR實驗、流式細胞儀檢測、CCK8實驗和克隆形成檢測、熒光素酶報告基因檢測、SPSS統(tǒng)計分析。結(jié)果:1、qRT-PCR結(jié)果顯示,與癌旁正常組織和HEK293T細胞相比,miR-181a在喉癌組織和Hep2細胞中表達水平顯著降低(P0.05),NPM1在喉癌組織和Hep2細胞中表達水顯著增高(P0.05),二者轉(zhuǎn)錄表達水平呈顯著負相關(guān)關(guān)系(r=-0.4185,P0.01)。Western blot結(jié)果顯示,與癌旁正常組織和相比,NPM1在喉癌組織中蛋白表達水平顯著增高(P0.05)。上述結(jié)果提示miR-181a和NPM1在喉癌中分別發(fā)揮潛在抑癌基因和癌基因作用。2、熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示,在Hep2細胞系中,LutNPM1-Wt+mi R-181a mimic共轉(zhuǎn)染組報告基因活性較對照組顯著下降(P0.05)。Real-time PCR和Western blot結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-181a mimic或mi R-181a inhibitor后48h,與對照組相比,Hep2細胞中NPM1 mRNA和蛋白表達水平分別顯著降低和增高(P0.05)。上述結(jié)果提示NPM1是miR-181a的靶基因。3、CCK8和克隆形成實驗結(jié)果表明,與對照組相比,miR-181a mimic轉(zhuǎn)染組中Hep2細胞的增殖及克隆形成能力顯著降低(P0.05),miR-181a inhibitor轉(zhuǎn)染組中Hep2細胞增殖及克隆形成能力顯著增高(P0.05),提示miR-181a抑制Hep2細胞的增殖。4、流式細胞術(shù)檢測凋亡結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染miR-181a mimic或miR-181a inhibitor后48h,Hep2細胞的早期凋亡比例較對照組分別顯著升高或降低(P0.05),提示miR-181a促進Hep2細胞的凋亡。5、流式細胞術(shù)檢測周期結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染miR-181a mimic后48h,與對照組相比,位于S期的細胞比例顯著增加(P0.05),而位于G0/G1期和G2/M期的細胞比例則顯著減少(P0.05),提示miR-181a通過誘導(dǎo)細胞發(fā)生S期阻滯,進而抑制喉癌細胞的增殖。6、CCK8和克隆形成實驗結(jié)果表明,與對照組相比,過表達NPM1轉(zhuǎn)染組中Hep2細胞增殖能力及克隆形成數(shù)目顯著升高(P0.05),si-NPM1轉(zhuǎn)染組中Hep2細胞增殖能力及克隆形成數(shù)目顯著降低(P0.05),提示NPM1促進Hep2細胞的增殖。7、流式細胞術(shù)檢測凋亡結(jié)果表明,si-NPM1轉(zhuǎn)染組中Hep2細胞早期凋亡比例較對照組顯著升高(P0.05),過表達NPM1組中Hep2細胞早期凋亡比例與對照組相比無明顯差異(P0.05),提示敲減NPM1可促進Hep2細胞早期凋亡。8、流式細胞術(shù)檢測周期結(jié)果表明,si-NPM1和NPM1轉(zhuǎn)染后48h,與對照組相比,位于G0/G1期的細胞比例分別顯著增加和減少(P0.05);位于S及G2/M期的細胞比例分別顯著減少和增加(P0.05),提示NPM1通過誘導(dǎo)細胞由G0/G1期向S期的演進,進而促進喉癌細胞的增殖。結(jié)論:1、miR-181a和NPM1在喉癌中分別下調(diào)和上調(diào),二者在轉(zhuǎn)錄水平呈負相關(guān)關(guān)系,提示二者在喉癌中分別發(fā)揮抑癌基因和癌基因作用。2、NPM1是mi R-181a直接靶基因。3、miR-181a和NPM1分別抑制和促進喉癌細胞增殖,其中前者通過S期阻滯抑制喉癌細胞增殖,而后者通過誘導(dǎo)G0/G1期向S期的演進促進喉癌細胞增殖。4、mi R-181a和NPM1分別促進和抑制喉癌細胞早期凋亡,而且,NPM1回復(fù)mi R-181a對喉癌細胞凋亡的促進作用,提示mi R-181a通過抑制NPM1促進喉癌細胞凋亡。
【圖文】：

中國醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文3 結(jié)果3.1 miR-181a 在喉癌組織和喉癌 Hep2 細胞中表達下調(diào)應(yīng)用 qRT-PCR 檢測 miR-181a 在 47 例喉癌組織及相應(yīng)癌旁組織表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在 47 例標本中，miR-181a 在 40 例（85%）喉癌組織中表達水平低于癌旁組織（圖 1A）；統(tǒng)計學(xué)結(jié)果表明，miR-181a 在 47 例喉癌組織中平均表達量顯著低于癌旁組織（圖 1B，P<0.05）；應(yīng)用 qRT-PCR 檢測 miR-181a 在喉癌 Hep2 細胞、人胚腎 HEK293T 細胞中表達，統(tǒng)計結(jié)果顯示 miR-181a 在 Hep2 細胞中內(nèi)源性表達水平顯著低于 HEK-293T 細胞（圖 1C，P<0.001）。

中國醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文3.2 NPM1 在喉癌組織和喉癌 Hep2 細胞中表達上調(diào)選取 45 對新鮮喉癌組織及相應(yīng)癌旁組織，，應(yīng)用 qRT-PCR 檢測 NPM1 mRNA的表達水平，結(jié)果顯示，NPM1 在 39 例（87%）喉癌組織中表達高于癌旁組織（圖2.1A）；統(tǒng)計學(xué)結(jié)果表明 NPM1 在 45 例喉癌組織中平均表達量顯著高于癌旁組織(圖2.1B，P<0.001)；應(yīng)用 qRT-PCR 檢測 NPM1 在喉癌 Hep2 細胞、人胚腎 HEK293T細胞中表達，統(tǒng)計結(jié)果提示 NPM1 在喉癌 Hep2 細胞中內(nèi)源性表達水平顯著高于HEK-293T 細胞（圖 2.1C，P<0.05）；相關(guān)分析結(jié)果顯示喉癌組織中 miR-181a mRNA表達水平與 NPM1 mRNA 表達水平呈顯著負性相關(guān) r=-0.4185（圖 2.1D，P<0.01），進一步說明 miR-181a 與 NPM1 存在調(diào)控關(guān)系。同時，我們應(yīng)用 Western blotting 檢測了 NPM1 在 32 對喉癌組織及相應(yīng)癌旁組織中的蛋白表達水平，結(jié)果所示在喉癌組織中 NPM1 蛋白平均表達量顯著高于癌旁組織（圖 2.2，P<0.001）。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R739.65

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本文編號：2601133