【摘要】：以年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration, AMD)、原發(fā)性視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa, RP)等為代表的外層視網(wǎng)膜變性性疾病是目前世界范圍內(nèi)主要的致盲眼病之一,其共同的病理改變?yōu)楣飧惺芷骷毎豢赡嫘缘牡蛲�。此類疾病的分子病理機制及治療是目前研究的難點。 近年來小膠質(zhì)細胞的作用逐漸受到重視。光感受器損傷后激活小膠質(zhì)細胞,導(dǎo)致進一步神經(jīng)元損傷已得到證實。但光感受器損傷和小膠質(zhì)細胞激活之間的分子對話機制仍不清楚,阻止該過程成為從同一途徑延緩視網(wǎng)膜變性發(fā)展的關(guān)鍵。研究提示趨化因子Fractalkine可能是二者功能對話的重要介質(zhì)。 本研究采用光損傷視網(wǎng)膜模型、體外光感受器和小膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)模式,研究Fractalkine及受體CX3CR1信號在光感受器損傷后的時空變化,著力于分析該信號的變化規(guī)律及與視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞激活、神經(jīng)元凋亡之間潛在的關(guān)系,并深入探討其調(diào)控小膠質(zhì)細胞激活的細胞內(nèi)信號途徑,闡明神經(jīng)元損傷和小膠質(zhì)細胞激活之間的分子機制,為延緩視網(wǎng)膜變性疾病的進展開拓新治療思路。 第一部分 Fractalkine/CX3CR1在光損傷大鼠模型中的表達時空變化規(guī)律及與小膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元關(guān)系的研究 目的：探討Fractalkine及其受體CX3CR1在光損傷大鼠模型中的表達時空變化規(guī)律,并著重分析比較其時空變化與神經(jīng)元凋亡及小膠質(zhì)細胞遷移活化之間的可能關(guān)系。 方法：將SD大鼠置于光損傷箱中接受24h強度為25001ux的寬譜藍光照射,制成Ⅰ型光損傷動物模型,選取光損傷后的2h、6h、1d、3d、5d、7d為觀察檢測時間點。采用HE (hematoxylin and eosin)染色觀察不同時間節(jié)點光損傷大鼠外核層的厚度及感光細胞數(shù)目變化情況。采用免疫組化熒光觀察視網(wǎng)膜病變不同階段小膠質(zhì)細胞的活化遷移及Fractalkine/CX3CR1的表達部位及表達量的變化,用原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法(TUNEL)檢測視網(wǎng)膜光感受器凋亡情況,利用Western blot、 Real Time-PCR檢測Fractalkine/CX3CR1、炎癥因子TNF-α、IL-1β的蛋白及mRNA表達變化情況,進一步從分子信號水平觀察MAPK家族的表達變化情況。綜合以上檢測結(jié)果分析尋找Fractalkine/CX3CR1與光感受器凋亡、小膠質(zhì)細胞遷移活化及炎癥因子分泌之間的關(guān)系。 結(jié)果：HE染色顯示光損傷后大鼠視網(wǎng)膜出現(xiàn)進行性光感受器減少和外核層變薄,且光感受器內(nèi)外節(jié)結(jié)構(gòu)紊亂。免疫熒光顯示光損傷后感光細胞層出現(xiàn)Fractalkine表達增多,與小膠質(zhì)細胞活化遷移的位置較一致,其受體CX3CR1在視網(wǎng)膜內(nèi)主要表達于小膠質(zhì)細胞。Western blot、Real Time-PCR可見Fractalkine/CX3CR1蛋白和mRNA出現(xiàn)表達上調(diào),分別在損傷后1d、3d達到表達高峰。UNEL結(jié)果顯示光損傷后2h即出現(xiàn)明顯的感光細胞凋亡并隨著時間推移凋亡細胞數(shù)目增多,1d時達到凋亡高峰。觀察發(fā)現(xiàn)炎癥因子TNF-α、IL-1β以及MAPK家族中p-p38, p-p44/22和p-SAPK/JNK均出現(xiàn)了與上述指標(biāo)相吻合的表達水平波動。 結(jié)論：趨化因子Fractalkine及受體CX3CR1可能是視網(wǎng)膜感光細胞損傷和小膠質(zhì)細胞激活之間的重要分子對話機制,MAPK家族可能參與了Fractalkine/CX3CR1調(diào)控小膠質(zhì)細胞激活的細胞內(nèi)信號途徑的過程或者光誘導(dǎo)感光細胞凋亡的過程。 第二部分 Fractalkine/CX3CR1對體外共培養(yǎng)體系光感受器損傷和小膠質(zhì)細胞激活之間分子對話作用的研究 目的：探討損傷后的光感受器和視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞激活之間的交互對話信號,主要關(guān)注點是趨化因子Fractalkine及其受體CX3CR1在光損傷光感受器變性性疾病中的作用。 方法：將SD大鼠視網(wǎng)膜原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細胞與感光細胞系661W在transwell小室中進行共培養(yǎng),并置于特制的細胞照光箱中接受5h寬譜藍光照射制成細胞光損傷模型,選取光損傷后的6h、12h、24h、36h、48h為觀察檢測時間點。在共培養(yǎng)體系中預(yù)先加入CX3CR1中和性封閉抗體或膜結(jié)合形式Fractalkine或小分子可溶性Fractalkine作為不同的干預(yù)組。采用Elisa法檢測可溶性小分子Fractalkine、炎癥因子TNF-α和IL-1β的分泌情況,TUNEL法檢測感光細胞系661W凋亡情況,通過趨化實驗觀察可溶性小分子Fractalkine對小膠質(zhì)細胞遷移的作用。 結(jié)果：藍光損傷后70%-80%的感光細胞系661W出現(xiàn)了凋亡,與之共培養(yǎng)的小膠質(zhì)細胞則出現(xiàn)了激活的形態(tài)學(xué)表現(xiàn),由分支狀變?yōu)榘⒚装蜖?并且小分子Fractalkine和炎癥因子在細胞上清液中的表達升高。與對照組相比,在CX3CR1中和性封閉抗體組出現(xiàn)了較多的感光細胞存活,加入外源性的膜結(jié)合形式Fractalkine和小分子可溶性Fractalkine分別表現(xiàn)出為減少感光細胞凋亡和促進小膠質(zhì)細胞遷移的作用。 結(jié)論：初步證實了藍光損傷感光細胞系661W可導(dǎo)致Fractalkine裂解,并通過Fractalkine/CX3CR1途徑激活小膠質(zhì)細胞。而激活的小膠質(zhì)細胞可釋放炎癥因子反過來加重感光細胞原有的損傷。對趨化因子Fractalkine及受體CX3CR1參與視網(wǎng)膜感光細胞損傷和小膠質(zhì)細胞激活之間的分子對話的研究,為延緩視網(wǎng)膜變性疾病的進展開拓新治療思路,進一步將研究Fractalkine/CX3CR1激活小膠質(zhì)細胞的細胞內(nèi)信號途徑,為調(diào)控該信號通路、抑制小膠質(zhì)細胞過度激活開辟新的治療途徑提供理論依據(jù)。
【圖文】：

從旦大學(xué)博士學(xué)位論文四實驗結(jié)果(一）光損傷誘導(dǎo)光感受器變性調(diào)亡的情況根據(jù)實驗設(shè)計，我們順利將SD大鼠制成光損傷視網(wǎng)膜變性模型，從形態(tài)學(xué)角度分析了光感受器的存活情況，并用TUNEL法檢測視網(wǎng)膜細胞調(diào)亡情況。結(jié)果顯示SD大鼠經(jīng)過24h光損傷后，在2h、6h、Id、3d、5d、7d七個時間點分別取光照組和對照組大鼠視網(wǎng)膜，，采用HE染色觀察視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)層次的變化，發(fā)現(xiàn)進行性光感受器減少和外核層變薄，且光感受器內(nèi)外節(jié)結(jié)構(gòu)紊亂（見圖1A-E，箭頭所示為外核層）。

記的小膠質(zhì)細胞只存在于內(nèi)層視網(wǎng)膜，包括感光細胞層、內(nèi)叢狀層、內(nèi)核層（見圖3A)。光損傷以后，越來越多的小膠質(zhì)細胞開始由視網(wǎng)膜內(nèi)層向外層遷移，甚至到達視網(wǎng)膜下腔（見圖3B)。另外，視網(wǎng)膜鋪片免疫組化顯示正常組視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞呈分支突起狀（見圖3C)，光損傷后的小膠質(zhì)細胞呈阿米巴狀（見圖3D),小膠質(zhì)細胞這些行為學(xué)和形態(tài)學(xué)的改變提示進入了激活狀態(tài)，這與以往的相關(guān)報道較一致。Normal sd圖3免疫焚光示小膠質(zhì)細胞激活遷移情況。A正常視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞主要存在于內(nèi)層視網(wǎng)膜。B光損傷后3d,大量小膠質(zhì)細胞由視網(wǎng)膜內(nèi)層向外層遷移。C-D視網(wǎng)膜鋪片上小膠質(zhì)細胞的形態(tài)也由靜止?fàn)顟B(tài)的分支狀變?yōu)榛罨癄顟B(tài)的阿米巴狀。(三）Fractalkine/CX3CR1在光損傷模型中的表達及變化情況通過對不同時間節(jié)點各組視網(wǎng)膜進行免疫組化檢測，我們發(fā)現(xiàn)Fractalkine在正常視網(wǎng)膜中分布較為廣泛，但是量較少，而光損傷后視網(wǎng)膜Fractalkine的表達出現(xiàn)顯著上升，免疫組化顯示表達升高的部位主要位于感光細胞層，6h即可觀察到外節(jié)盤部位出現(xiàn)表達上調(diào)
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R774.13

【共引文獻】

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本文編號：2575782