【摘要】：以年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration, AMD)、原發(fā)性視網膜色素變性(retinitis pigmentosa, RP)等為代表的外層視網膜變性性疾病是目前世界范圍內主要的致盲眼病之一,其共同的病理改變?yōu)楣飧惺芷骷毎豢赡嫘缘牡蛲�。此類疾病的分子病理機制及治療是目前研究的難點。 近年來小膠質細胞的作用逐漸受到重視。光感受器損傷后激活小膠質細胞,導致進一步神經元損傷已得到證實。但光感受器損傷和小膠質細胞激活之間的分子對話機制仍不清楚,阻止該過程成為從同一途徑延緩視網膜變性發(fā)展的關鍵。研究提示趨化因子Fractalkine可能是二者功能對話的重要介質。 本研究采用光損傷視網膜模型、體外光感受器和小膠質細胞共培養(yǎng)模式,研究Fractalkine及受體CX3CR1信號在光感受器損傷后的時空變化,著力于分析該信號的變化規(guī)律及與視網膜小膠質細胞激活、神經元凋亡之間潛在的關系,并深入探討其調控小膠質細胞激活的細胞內信號途徑,闡明神經元損傷和小膠質細胞激活之間的分子機制,為延緩視網膜變性疾病的進展開拓新治療思路。 第一部分 Fractalkine/CX3CR1在光損傷大鼠模型中的表達時空變化規(guī)律及與小膠質細胞和神經元關系的研究 目的：探討Fractalkine及其受體CX3CR1在光損傷大鼠模型中的表達時空變化規(guī)律,并著重分析比較其時空變化與神經元凋亡及小膠質細胞遷移活化之間的可能關系。 方法：將SD大鼠置于光損傷箱中接受24h強度為25001ux的寬譜藍光照射,制成Ⅰ型光損傷動物模型,選取光損傷后的2h、6h、1d、3d、5d、7d為觀察檢測時間點。采用HE (hematoxylin and eosin)染色觀察不同時間節(jié)點光損傷大鼠外核層的厚度及感光細胞數(shù)目變化情況。采用免疫組化熒光觀察視網膜病變不同階段小膠質細胞的活化遷移及Fractalkine/CX3CR1的表達部位及表達量的變化,用原位末端轉移酶標記法(TUNEL)檢測視網膜光感受器凋亡情況,利用Western blot、 Real Time-PCR檢測Fractalkine/CX3CR1、炎癥因子TNF-α、IL-1β的蛋白及mRNA表達變化情況,進一步從分子信號水平觀察MAPK家族的表達變化情況。綜合以上檢測結果分析尋找Fractalkine/CX3CR1與光感受器凋亡、小膠質細胞遷移活化及炎癥因子分泌之間的關系。 結果：HE染色顯示光損傷后大鼠視網膜出現(xiàn)進行性光感受器減少和外核層變薄,且光感受器內外節(jié)結構紊亂。免疫熒光顯示光損傷后感光細胞層出現(xiàn)Fractalkine表達增多,與小膠質細胞活化遷移的位置較一致,其受體CX3CR1在視網膜內主要表達于小膠質細胞。Western blot、Real Time-PCR可見Fractalkine/CX3CR1蛋白和mRNA出現(xiàn)表達上調,分別在損傷后1d、3d達到表達高峰。UNEL結果顯示光損傷后2h即出現(xiàn)明顯的感光細胞凋亡并隨著時間推移凋亡細胞數(shù)目增多,1d時達到凋亡高峰。觀察發(fā)現(xiàn)炎癥因子TNF-α、IL-1β以及MAPK家族中p-p38, p-p44/22和p-SAPK/JNK均出現(xiàn)了與上述指標相吻合的表達水平波動。 結論：趨化因子Fractalkine及受體CX3CR1可能是視網膜感光細胞損傷和小膠質細胞激活之間的重要分子對話機制,MAPK家族可能參與了Fractalkine/CX3CR1調控小膠質細胞激活的細胞內信號途徑的過程或者光誘導感光細胞凋亡的過程。 第二部分 Fractalkine/CX3CR1對體外共培養(yǎng)體系光感受器損傷和小膠質細胞激活之間分子對話作用的研究 目的：探討損傷后的光感受器和視網膜小膠質細胞激活之間的交互對話信號,主要關注點是趨化因子Fractalkine及其受體CX3CR1在光損傷光感受器變性性疾病中的作用。 方法：將SD大鼠視網膜原代培養(yǎng)的小膠質細胞與感光細胞系661W在transwell小室中進行共培養(yǎng),并置于特制的細胞照光箱中接受5h寬譜藍光照射制成細胞光損傷模型,選取光損傷后的6h、12h、24h、36h、48h為觀察檢測時間點。在共培養(yǎng)體系中預先加入CX3CR1中和性封閉抗體或膜結合形式Fractalkine或小分子可溶性Fractalkine作為不同的干預組。采用Elisa法檢測可溶性小分子Fractalkine、炎癥因子TNF-α和IL-1β的分泌情況,TUNEL法檢測感光細胞系661W凋亡情況,通過趨化實驗觀察可溶性小分子Fractalkine對小膠質細胞遷移的作用。 結果：藍光損傷后70%-80%的感光細胞系661W出現(xiàn)了凋亡,與之共培養(yǎng)的小膠質細胞則出現(xiàn)了激活的形態(tài)學表現(xiàn),由分支狀變?yōu)榘⒚装蜖?并且小分子Fractalkine和炎癥因子在細胞上清液中的表達升高。與對照組相比,在CX3CR1中和性封閉抗體組出現(xiàn)了較多的感光細胞存活,加入外源性的膜結合形式Fractalkine和小分子可溶性Fractalkine分別表現(xiàn)出為減少感光細胞凋亡和促進小膠質細胞遷移的作用。 結論：初步證實了藍光損傷感光細胞系661W可導致Fractalkine裂解,并通過Fractalkine/CX3CR1途徑激活小膠質細胞。而激活的小膠質細胞可釋放炎癥因子反過來加重感光細胞原有的損傷。對趨化因子Fractalkine及受體CX3CR1參與視網膜感光細胞損傷和小膠質細胞激活之間的分子對話的研究,為延緩視網膜變性疾病的進展開拓新治療思路,進一步將研究Fractalkine/CX3CR1激活小膠質細胞的細胞內信號途徑,為調控該信號通路、抑制小膠質細胞過度激活開辟新的治療途徑提供理論依據(jù)。
【圖文】：

從旦大學博士學位論文四實驗結果(一）光損傷誘導光感受器變性調亡的情況根據(jù)實驗設計，我們順利將SD大鼠制成光損傷視網膜變性模型，從形態(tài)學角度分析了光感受器的存活情況，并用TUNEL法檢測視網膜細胞調亡情況。結果顯示SD大鼠經過24h光損傷后，在2h、6h、Id、3d、5d、7d七個時間點分別取光照組和對照組大鼠視網膜，，采用HE染色觀察視網膜結構層次的變化，發(fā)現(xiàn)進行性光感受器減少和外核層變薄，且光感受器內外節(jié)結構紊亂（見圖1A-E，箭頭所示為外核層）。

記的小膠質細胞只存在于內層視網膜，包括感光細胞層、內叢狀層、內核層（見圖3A)。光損傷以后，越來越多的小膠質細胞開始由視網膜內層向外層遷移，甚至到達視網膜下腔（見圖3B)。另外，視網膜鋪片免疫組化顯示正常組視網膜小膠質細胞呈分支突起狀（見圖3C)，光損傷后的小膠質細胞呈阿米巴狀（見圖3D),小膠質細胞這些行為學和形態(tài)學的改變提示進入了激活狀態(tài)，這與以往的相關報道較一致。Normal sd圖3免疫焚光示小膠質細胞激活遷移情況。A正常視網膜小膠質細胞主要存在于內層視網膜。B光損傷后3d,大量小膠質細胞由視網膜內層向外層遷移。C-D視網膜鋪片上小膠質細胞的形態(tài)也由靜止狀態(tài)的分支狀變?yōu)榛罨癄顟B(tài)的阿米巴狀。(三）Fractalkine/CX3CR1在光損傷模型中的表達及變化情況通過對不同時間節(jié)點各組視網膜進行免疫組化檢測，我們發(fā)現(xiàn)Fractalkine在正常視網膜中分布較為廣泛，但是量較少，而光損傷后視網膜Fractalkine的表達出現(xiàn)顯著上升，免疫組化顯示表達升高的部位主要位于感光細胞層，6h即可觀察到外節(jié)盤部位出現(xiàn)表達上調
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R774.13

【共引文獻】

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本文編號：2575782