【摘要】：白內(nèi)障,定義為全部或部分眼睛的晶狀體混濁,可分為兩大類(lèi)：先天性和年齡相關(guān)性白內(nèi)障。先天性白內(nèi)障的患病率估計(jì)為每萬(wàn)新生嬰兒中2.2-2.5例,其中約50%可遺傳。同白內(nèi)障相關(guān)的晶狀體蛋白基因突變發(fā)生在所有三個(gè)晶狀體蛋白家族中(α-,β-和γ-晶狀體蛋白),并顯示為不同的表型。目前,至少有60例遺傳性白內(nèi)障己被記錄在案,均由單基因突變引起,相應(yīng)突變氨基酸也被確定。有些人源γD-晶狀體蛋白(HGD)突變體同先天性白內(nèi)障有著密切聯(lián)系,但是詳細(xì)的突變相關(guān)性白內(nèi)障形成的分子機(jī)制尚不明確。 基于HGD涉及到蛋白質(zhì)沉淀疾病,即白內(nèi)障的形成,本論文以HGD為對(duì)象,研究三種HGD的突變體W42R, R76S和P23T的結(jié)構(gòu),折疊以及組裝,探究該晶狀體結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系,進(jìn)而闡明白內(nèi)障形成的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。 (1)部分去折疊HGD的中間體,可能使蛋白質(zhì)聚集沉淀并最終導(dǎo)致晶狀體的模糊,人源γD晶狀體蛋白突變體同遺傳性白內(nèi)障的形成具有緊密的聯(lián)系。來(lái)源于中國(guó)人家庭與白內(nèi)障相關(guān)的γD晶狀體蛋白突變體(W42R),表現(xiàn)為常染色體顯性遺傳,突變體蛋白較HGD溶解性大大下降。我們解析了W42R突變體的晶體結(jié)構(gòu),分辨率1.7A,同HGD的晶體結(jié)構(gòu)相比較只發(fā)現(xiàn)了微小的變化。令人感興趣的是,W42R突變體蛋白酶水解非常敏感,表明小量部分去折疊成分的存在；核磁共振波譜實(shí)驗(yàn)證實(shí)并定量分析了部分去折疊成分的存在；氫/氘交換實(shí)驗(yàn)也揭示了部分去折疊成分同天然折疊成分之間的化學(xué)交換,只是W42R突變體的交換速度及其緩慢。同時(shí),HGD的紫外線輻射實(shí)驗(yàn),導(dǎo)致了蛋白分子N端區(qū)域的損傷,輻射后的蛋白對(duì)蛋白酶具有同W42R突變體相似的敏感性。所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)允許我們建立一個(gè)基于W42R致病機(jī)理的模型,即W42R突變體致病機(jī)理可以作為光損傷和年齡相關(guān)白內(nèi)障的代表。 (2)R76S是一個(gè)從一個(gè)印度家庭新發(fā)現(xiàn)的與遺傳性白內(nèi)障相關(guān)的HGD突變體,我們?cè)诖竽c桿菌中表達(dá)了該突變體蛋白,通過(guò)圓二色,熒光以及NMR確定了蛋白熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性。出乎意料的是,R76S突變體,除了擁有較低的等電點(diǎn)外,在生物物理和生物化學(xué)性質(zhì)方面同HGD并無(wú)明顯不同,通過(guò)NMR確定的R76S突變體的液體結(jié)構(gòu),包括殘余偶極耦合(Resicual Dipoie Couplings, RDCs),弛豫測(cè)定,表面其與突變體具有近似相同的液體結(jié)構(gòu)。同時(shí),變性/復(fù)性動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)表明無(wú)論R76S突變體還是野生型突變體都顯示了類(lèi)似的被αB-晶狀體蛋白抑制的經(jīng)由錯(cuò)誤折疊途徑產(chǎn)生的沉淀。綜上所述,研究結(jié)果表明結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性的變化都不是R76S突變體導(dǎo)致白內(nèi)障產(chǎn)生的原因,但是,等電點(diǎn)的改變和相關(guān)表面電位的變化或者氨基酸殘基天然性質(zhì)的變化極有可能影響到R76S突變體與晶狀體中其他蛋白家族的相互作用。 (3)與白內(nèi)障相關(guān)的HGD P23T突變體具有地理上廣泛分布和表型多樣的特性。23位氨基酸殘基的突變極大的降低了蛋白質(zhì)本身的溶解性。由于缺乏P23T突變體的X-ray晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù),在分子水平上對(duì)突變體本身的理解并不充分。本論文工作首次成功解析了P23T突變體的晶體結(jié)構(gòu),P23T突變體采用P21的結(jié)晶群,每個(gè)不對(duì)稱(chēng)單元包含兩個(gè)蛋白質(zhì)分子。同野生型HGD相比,除了一些細(xì)微的差別,P23T突變體結(jié)構(gòu)基本保持不變。這些細(xì)微差別包括：Trp42的側(cè)鏈與不同的氨基酸殘基形成了新的氫鍵,結(jié)果發(fā)生了小角度的轉(zhuǎn)向；同時(shí)我們計(jì)算P23T突變體和HGD的溶液可接觸表面積(SASA),結(jié)果并無(wú)明顯差異。有報(bào)道表明P23T突變體溶解度表現(xiàn)為溫度退行性(隨溫度的增加溶解度降低)。在我們的研究中,P23T突變體的溶解度顯示出離子強(qiáng)度依賴(lài)性,發(fā)現(xiàn)在NaCl的存在下P23T突變體的沉淀聚集被部分抑制。綜上所述,研究結(jié)果表明結(jié)構(gòu)的變化并不是P23T突變體導(dǎo)致白內(nèi)障產(chǎn)生的原因,但是Thr取代Pro確實(shí)改變了蛋白質(zhì)分子間的相互作用。 綜上所述,論文研究表征了W42R突變體的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)并揭示了其同年齡相關(guān)白內(nèi)障之間的聯(lián)系；排除了R76S突變由于自身蛋白-蛋白相互作用導(dǎo)致白內(nèi)障的可能性；首次解析了P23T突變體的晶體結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明突變帶來(lái)的HGD主要空間構(gòu)象上的變化對(duì)白內(nèi)障的發(fā)生并不是必要的；但是,突變確實(shí)改變了蛋白質(zhì)分子在溶液中的特性,即不同突變體的變性／復(fù)性動(dòng)力學(xué),在白內(nèi)障形成中扮演了至關(guān)重要的角色。
【學(xué)位授予單位】：大連理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R776.1

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本文編號(hào)：2573512