本文關(guān)鍵詞：HIV-1進入視網(wǎng)膜色素上皮細胞及其傳播的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景：獲得性免疫缺陷綜合征(Acquired immunodeficiency syndrome, AIDS),又稱為艾滋病,它是由人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV-1)引起的,會造成人類免疫系統(tǒng)缺陷的一種逆轉(zhuǎn)錄病毒,該種病毒會破壞人免疫系統(tǒng),最終導(dǎo)致一系列的機會性感染和腫瘤。隨著抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療方案的完善和全球?qū)IDS治療的各種投入,AIDS己成為一種慢性可控的感染性疾病,艾滋病人的壽命極大地延長。但是,由于艾滋病人壽命的延長,攜帶HIV的人數(shù)持續(xù)上升,感染者呈老齡化趨勢,而且只有大約1/5的感染者能享受藥物治療。因此,感染者/發(fā)病者所面臨的各種并發(fā)癥極大的影響了病人的生存質(zhì)量。眼部并發(fā)癥是HIV-1感染者最常見的癥狀之一,眼部表現(xiàn)往往是HIV-1患者全身播散性感染的首要表現(xiàn),大約45%-75%的HIV-1患者眼部會受到侵犯,臨床上把眼部并發(fā)癥作為HIV-1癥狀檢測的一個指標,甚至有少數(shù)患者作為首發(fā)癥狀就醫(yī)。大多數(shù)的HIV-1感染者的視網(wǎng)膜發(fā)病都會出現(xiàn)視網(wǎng)膜微血管滲漏、神經(jīng)纖維層變薄、內(nèi)皮細胞腫脹、血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)等病理特征。視網(wǎng)膜病變嚴重威脅著艾滋病人的視力,使患者的色覺分辨能力、調(diào)節(jié)能力和對比敏感度能力有不同程度的下降,嚴重時會導(dǎo)致患者失明。由于在無或者有眼科癥狀的HIV-1感染者的視網(wǎng)膜組織內(nèi)部的各層細胞中都檢測到HIV-1的抗原,因此,HIV-1直接進入視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)被認為是導(dǎo)致HIV視網(wǎng)膜并發(fā)癥的主要原因。艾滋病不可治愈,最主要原因是HIV病毒能潛伏在人的各個組織和器官中,抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療不能殺滅潛伏的病毒。密西西比女嬰“功能性治愈”失敗的例子和科學(xué)家在猴子感染模型上的實驗證明,即使在感染早期給予感染者抗病毒藥物治療,當治療停止后,病毒仍然會復(fù)蘇。這些結(jié)果提示,病毒能在感染早期階段就建立HIV儲存庫,清除病毒儲存庫是治愈艾滋病的關(guān)鍵問題。除了CD4+T淋巴細胞,神經(jīng)系統(tǒng)、視網(wǎng)膜、睪丸等都是HIV-1潛伏的理想之所。人視網(wǎng)膜色素上皮細胞(human retinal pigment epithelium, HRPE)位于視神經(jīng)網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜毛細血管層之間,依靠完整的細胞間緊密鏈接,構(gòu)成血—視網(wǎng)膜外屏障。血—視網(wǎng)膜外屏障類似血腦屏障,可選擇性調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜神經(jīng)組織的局部微環(huán)境,保護視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞不受血液中炎癥細胞及細胞毒性產(chǎn)物的影響。因此血-視網(wǎng)膜外屏障對調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜的微環(huán)境,維持其穩(wěn)態(tài)起重要的作用。我們前期研究中表明,HIV長時間作用于HRPE (48 h),病毒包膜蛋白gp120會誘導(dǎo)HRPE的炎癥反應(yīng),從而導(dǎo)致HRPE屏障功能的破壞并且HRPE的通透性增加。但是,我們進一步研究表明,HIV-1短暫作用于HRPE后,2小時即可在細胞內(nèi)檢測到病毒的核心抗原p24。病毒除了通過旁通路影響HRPE的功能,病毒很可能直接感染HRPE。本文選擇視網(wǎng)膜色素上皮細胞作為研究對象,深入探討HIV-1進入視網(wǎng)膜色素上皮細胞的途徑以及病毒進入細胞后發(fā)生的分子事件,期望闡明病毒致視網(wǎng)膜疾病的機制及病毒在視網(wǎng)膜中建立潛伏感染的機制,尋找潛在的藥物靶點。研究目的：通過體外培養(yǎng)的D407細胞,建立體外的視網(wǎng)膜上皮細胞屏障模型。利用流式細胞技術(shù)、western blotting、共聚焦顯微鏡等多種方法研究病毒進入D407細胞,采用化學(xué)抑制劑的方法探討病毒進入D407細胞的具體機制,采用PCR技術(shù)檢測病毒在D407細胞中的整合作用,利用溶酶體的標記物和溶酶體中的蛋白酶抑制劑等檢測病毒在細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運過程；最后通過共培養(yǎng)的方式來檢測病毒在細胞-細胞間的傳播。本文旨在探討HIV-1進入視網(wǎng)膜色素上皮細胞的機制以及病毒進入細胞后發(fā)生的分子事件。預(yù)期闡明病毒致視網(wǎng)膜疾病的機制及病毒在視網(wǎng)膜中可能建立的潛伏感染,尋找潛在的藥物治療靶點。研究方法：1.克隆病毒的制備及其感染力的檢測1)將SF162(R5受體嗜性)病毒全長基因的質(zhì)粒和NL4-3(X4受體嗜性)病毒全長基因的質(zhì)粒,分別轉(zhuǎn)染至293TX細胞中制備感染性克隆病毒。2)將轉(zhuǎn)染得到的HIV-1克隆病毒分別稀釋2、4、8、16、32、64倍六個濃度,100分μl/孔,加入到提前12h鋪好的TZM-B1細胞的96孔板中,48 h后用luciferase報告基因檢測試劑盒檢測。2.檢測D407細胞表面受體的表達1)流式細胞儀檢測：D407鋪板36 h后,用0.025%的EDTA消化細胞,PBS重懸,1 μg/ml anti-CD4、anti-CCR5、anti-CXCR4的抗體4℃孵育1 h,1 μg/ml的鼠源性二抗4℃孵育40min, PBS重懸后,流式細胞儀檢測。2) RT-PCR檢測：依據(jù)基因組試劑盒的說明書,提取D407細胞的基因組,參考文獻設(shè)計CD4、CXCR4、CCR5等受體基因的引物序列,基因組直接進行RT-PCR實驗,用7500軟件查看各樣品的溶解曲線和循環(huán)數(shù)。3.檢測HIV-1能否感染D407細胞1)ELISA檢測(以R5受體嗜性的病毒為例)：將病毒處理CEMX1745.25M7細胞和D407細胞6 h,胰酶消化收集細胞,PBS洗滌3次,培養(yǎng)基重懸,1×105個/孔鋪板,分別在第1、3、5、7天取500μ1上清裂解,用ELISA檢測上清中p24的含量。4.檢測HIV-1能夠進入D407細胞1)流式細胞儀檢測：將D407細胞2×105個/孔鋪板,12 h后加入EGFP標記的HIV-1,37℃孵育2 h,胰酶消化、重懸,PBS混懸均勻,上機檢測。2) Western blotting檢測：將D407細胞2×105個/孔鋪板,24 h后分別加入不同的HIV-1,37℃孵育2 h,胰酶消化、重懸、離心,PBS洗滌3次,用細胞裂解液RIPA裂解、收集蛋白,檢測核心抗原p24蛋白。3)共聚焦顯微鏡檢測：將D407細胞2×105個/孔鋪板,24 h后分別加入EGFP標記的克隆病毒,37℃孵育1h, PBS洗滌3次,加入2 gM的DiI(染細胞膜的紅色熒光染料)染色10min, PBS洗滌3次,4%的多聚甲醛固定15 min,PBS洗滌3次,DAPI染細胞核,在熒光共聚焦顯微鏡上觀察不同熒光所在的位置。5.HIV-1進入D407細胞的機制研究1)流式細胞儀檢測：將D407細胞2×105個/孔鋪板,孵育24 h后,分別加入不同的化學(xué)抑制劑處理細胞1 h,加入EGFP標記的R5受體嗜性的克隆病毒,處理1 h,胰酶消化、重懸,PBS混懸均勻,上機檢測。2) Western blotting檢測：將D407細胞2×105個/孔鋪板,孵育24 h后,加入不同濃度的各種抑制劑,處理1 h,加入克隆病毒,處理1 h,胰酶消化、重懸,離心,PBS洗滌3次,用細胞裂解液RIPA裂解、收集蛋白,檢測核心抗原p24蛋白。6.檢測進入D407細胞的病毒滯留情況1) Western blotting檢測：將D407細胞2×105個/孔鋪板24 h后,加入50μM的Pepastatin A和Leupeptin處理細胞,去掉藥物,加入1000 ng/ml的HIV-1處理1h,分別在0h、5h、10h、20 h和30 h收集細胞,處理后,用細胞裂解液RIPA裂解、收集蛋白,檢測核心抗原p24蛋白;運用相同的方法檢測病毒處理D407細胞30min、60 min、90min和120 min時,細胞內(nèi)EEAl的變化情況。2)熒光顯微鏡檢測：將D407細胞2×104個/ml,接種于共聚焦的培養(yǎng)皿中,24 h后,分別加入50μM的PepastatinA和Leupeptin以及R5受體嗜性的HIV-1處理1 h,去上清,PBS洗滌3次,4%的多聚甲醛固定15 min,100%的乙醇通透10 min,加入100μl稀釋后的EEA1抗體(溶酶體標記蛋白)4℃孵育過夜,PBS洗滌3次,加入CY3標記的鼠源性二抗室溫孵育1h,PBS洗滌3次,在熒光顯微鏡上觀察。3)PCR檢測病毒的整合：將D407細胞2×105個/孔鋪板,24 h后,加入病毒孵育48 h,收集細胞,提取基因組,用普通PCR和RT-PCR檢測：運用相同的實驗方法,檢測逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制劑對HIV-1整合的影響。7.檢測HIV在D407細胞和T淋巴細胞間的感染1)Transwell實驗：將D407細胞2×105個/孔鋪板,24 h后,加入HIV-1 SF162,處理1 h,胰酶消化、重懸,離心,PBS洗滌3次,用培養(yǎng)基重懸,將其重新鋪板到transwell上室中,下室加入CEMX174 5.25M7細胞,以正常的六孔板作為陽性對照,48 h培養(yǎng)后,用流式細胞儀和ELISA檢測病毒的感染情況,在相同的實驗條件下,用各種抑制劑處理D407細胞,檢測病毒感染靶細胞的情況。實驗結(jié)果：1.加入熒光病毒處理的D407細胞中,用熒光共聚焦顯微鏡可以在細胞內(nèi)部檢測到熒光病毒。隨著加入病毒孵育時間的延長,進入D407細胞累積的病毒先增加后減少達到一個穩(wěn)定的值,在1 h出現(xiàn)最大值;在37℃和4℃的環(huán)境中,進入D407細胞的病毒有顯著性的差異,在4℃時基本沒有病毒進入細胞；D407受體檢測時,D407細胞上CD4、CXCR4、CCR5三種受體的表現(xiàn)出來的熒光強度和空白組一致,而陽性細胞(U87·CD4·CCR5、MT-2、TZM-B1)表現(xiàn)出來的熒光強度與陰性對照相比有顯著的差別；2. Western blotting檢測時,只有氯丙嗪、氯化銨、奎寧、蔗糖等這一類Clathrin通路抑制劑對HIV-1進入D407細胞有抑制作用,并且有較好的線性相關(guān)性；而孕酮、阿米洛利、木杉酮、T-20等Caveolae、Macropinocytosis和融合抑制劑對HIV-1進入D407細胞沒有顯著地影響。3.HIV-1進入細胞以后,細胞內(nèi)的病毒量隨著時間的延長而逐漸減少；病毒進入溶酶體,被降解；有部分進入的病毒釋放其遺傳物質(zhì),病毒整合進入D407細胞的基因組中,這個整合過程可以被逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制劑(AZT)所阻斷。4.HIV-1克隆病毒可以在CD4+細胞中復(fù)制,并產(chǎn)生自代病毒,但不能在D407細胞中復(fù)制；用transwell隔開的內(nèi)含有病毒的D407不能感染CEMX1745.25M7,而正常共培養(yǎng)的細胞則可以感染CEMX174 5.25M7細胞；病毒在D407細胞和CEMX174 5.25M7細胞中的傳播能被氯丙嗪和CCR5抑制劑阻斷。實驗結(jié)論：1.HIV-1能夠以不依賴于CD4受體和CXCR4/CCR5輔助受體的方式進入D407細胞,并且這種進入的方式受時間和能量的影響。2.HIV-1進入視網(wǎng)膜色素上皮細胞是Clathrin介導(dǎo)的內(nèi)吞過程。3.HIV-1進入視網(wǎng)膜色素上皮細胞后會發(fā)生溶酶體的降解,并且病毒的基因可以整合到視網(wǎng)膜色素細胞基因組中。。4.HIV-1進入視網(wǎng)膜色素上皮細胞后可通過細胞-細胞間的傳播方式感染淋巴細胞,并且此過程可能是Clathrin和CCR4介導(dǎo)的。
【關(guān)鍵詞】：人類免疫缺陷病毒 視網(wǎng)膜色素上皮細胞 Clathrin 細胞-細胞間傳播
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R512.91;R774.1
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-19
• 前言19-26
• 第一章 HIV-1以非CD4受體依賴的方式進入視網(wǎng)膜色素上皮細胞26-53
• 一、實驗材料及儀器26-28
• 二、實驗方法28-38
• 三、實驗結(jié)果38-50
• 四、小結(jié)與討論50-53
• 第二章 HIV-1通過Clathrin介導(dǎo)的內(nèi)吞方式進入視網(wǎng)膜色素上皮細胞53-66
• 一、實驗材料及儀器53-54
• 二、實驗方法54-55
• 三、實驗結(jié)果55-64
• 四、小結(jié)與討論64-66
• 第三章 HIV-1可被溶酶體降解并發(fā)生病毒基因與視網(wǎng)膜色素上皮細胞基因組的整合66-78
• 一、實驗材料及儀器66-67
• 二、實驗方法67-70
• 三、實驗結(jié)果70-77
• 四、小結(jié)與討論77-78
• 第四章 HIV-1在視網(wǎng)膜色素上皮細胞與淋巴細胞間的傳播78-91
• 一、實驗材料及儀器78-79
• 二、實驗方法79-82
• 三、實驗結(jié)果82-89
• 四、小結(jié)與討論89-91
• 全文結(jié)論91-92
• 討論與展望92-95
• 參考文獻95-101
• 附錄：縮寫詞中英文對照表101-102
• 文章發(fā)表情況102-103
• 致謝103-105

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