【摘要】：研究背景鼻咽癌(]nasopharyngeal carcinoma, NPC)是我國南方高發(fā)的一種鼻咽部惡性上皮性腫瘤,由于鼻咽部位置隱蔽,患者早中期常無明顯不適癥狀,所以臨床早期診斷、可治療比例較低,確診的病例中70%已為中晚期,常伴有轉(zhuǎn)移,失去了最佳治療時期。臨床上治療主要采取放療為主,手術(shù)及化療為輔的方式進行治療,化療一般采取以鉑類化療藥為主的聯(lián)合放化療方案,雖然近幾十年,隨著整體醫(yī)療水平的提高,對鼻咽癌的早期診斷和治療手段有明顯提高,但五年生存率僅徘徊在50%-60%之間。復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移導(dǎo)致預(yù)后不良。因此,目前急切地需要尋找一種新的并且有效的方法來治療鼻咽癌。腫瘤干細胞(cancer stem cells, CSCs)研究是近年來生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的的一個研究熱點,腫瘤干細胞的理念用于解釋腫瘤細胞的異質(zhì)性已經(jīng)很久了,隨著對腫瘤干細胞研究的進一步深入,發(fā)現(xiàn)腫瘤干細胞是腫瘤形成和耐藥的根本原因。腫瘤干細胞具有自我更新、無限增殖、分化、高致瘤性等特性,并且在腫瘤生成、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和耐藥等過程中發(fā)揮重要的作用。鼻咽癌干細胞的研究是目前鼻咽癌研究領(lǐng)域的特點,而且越來越多的研究表明在鼻咽癌中存在腫瘤干細胞,并且發(fā)現(xiàn)腫瘤干細胞是鼻咽癌發(fā)生發(fā)展、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。因此,尋找一種能夠抑制或殺滅鼻咽癌腫瘤干細胞的有效手段對成功治療鼻咽癌至關(guān)重要。因為腫瘤干細胞在腫瘤細胞中占的比例極少,而且體外培養(yǎng)時,腫瘤干細胞迅速分裂增殖,不易進行體外擴增,因此體外大規(guī)模地培養(yǎng)腫瘤干細胞用于抗腫瘤干細胞藥物的篩選還未能實現(xiàn)。如何在體外獲得穩(wěn)定、富含腫瘤干細胞的細胞亞群是體外篩選抗腫瘤干細胞藥物的關(guān)鍵技術(shù)之一,也是我們首先要做的。目前腫瘤干細胞體外分離的常用方法有細胞表面分子標志物分選法(一些細胞表面蛋白如CD44、CD133和胚胎干細胞標記物已經(jīng)廣泛應(yīng)用于鑒定腫瘤干細胞)、側(cè)群細胞分選法(依賴ABCG2分子能將核特異性染料Hoechst 33342泵出細胞外,流式細胞儀檢測Hoechst染料陰性或弱陽性的為SP細胞這個原理,目前已有實驗證明SP細胞可應(yīng)用于鑒別和分選鼻咽癌腫瘤干細胞)、無血清懸浮培養(yǎng)法(含EGF、bFGF、B27等生長因子的無血清培養(yǎng)基可以使腫瘤干細胞在此條件下懸浮生長和體外擴增而不發(fā)生分化,因此通過無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)形成腫瘤細胞球可以用來富集腫瘤干細胞)、上皮間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化、PKH26標記(一種親脂性的紅色熒光染料,可與細胞膜的脂質(zhì)雙分子層不可逆結(jié)合,而腫瘤干細胞具有生長周期長,常處于相對靜止狀態(tài),目前已有報道PKH26可標記靜止期細胞,PKH26陽性細胞具有腫瘤干細胞性質(zhì),因此PKH26標記可作為腫瘤干細胞標記)、 乙醛脫氫酶(乙醛脫氫酶催化乙醛氧化成羧酸,是一系列氧化各種脂肪族醛、芳香族醛為相應(yīng)酸的酶,在生物體內(nèi)外的代謝中扮演著重要角色,ALDHlhigh是乳腺癌、肺癌、頭頸部腫瘤、胰腺癌、宮頸癌、前列腺癌、肝癌、腸癌和膀胱癌腫瘤干細胞的分子標記)等。當(dāng)前的觀點認為常規(guī)化療藥物只能殺傷占腫瘤絕大部分的非腫瘤干細胞,而不能有效地殺傷腫瘤干細胞�；熕幬镆驗槠錄]有選擇性、特異性,導(dǎo)致化療藥物在臨床使用時常常伴隨很大的副作用。因此,對腫瘤干細胞的深入研究,可以確認特異性針對腫瘤干細胞的藥物,對于臨床上治療腫瘤很關(guān)鍵。桑葉是�？粕僦参锷�(Morus alba L.)的葉子,性寒,味甘苦,具有疏散風(fēng)熱、清肺潤燥、清肝明目之功效,是常用中藥之一,在全國各地有廣泛的種植�，F(xiàn)代藥理研究證明,桑葉除了具有降血糖、清除自由基、抗菌、抗病毒等藥理作用外,還具有抗腫瘤活性。主要報道了黃酮類、生物堿類等若干化合物單體,對增殖腫瘤細胞具有抑制作用,動物在體評價較少,以腫瘤干細胞為靶點的活性成分研究尚未見相關(guān)報道。本論文旨在研究桑葉提取物(SangA)對鼻咽癌細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的影響,并在干細胞水平研究SangA對鼻咽癌腫瘤干細胞活性的影響。本研究以常規(guī)化療藥物順鉑作為陽性對照、水作為空白對照和DMSO作為溶劑對照,通過MTT、平板克隆、transwell侵襲、transwell遷移研究了桑葉提取物A(SangA)對鼻咽癌細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的作用；通過側(cè)群分析、腫瘤球形成及裸鼠體內(nèi)成瘤等相關(guān)實驗研究了桑葉提取物A (SangA)和對鼻咽癌腫瘤干細胞的作用。證明了桑葉提取物A(SangA)可以有效地抑制鼻咽癌細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移,以及有效地抑制鼻咽癌腫瘤干細胞。研究目的1.檢測SangA抑制鼻咽癌細胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移的作用2.從細胞和整體動物兩個層面全面評價SangA的抗鼻咽癌干細胞活性。研究方法1.細胞和培養(yǎng)條件：本實驗所用細胞均由本實驗室保存。人鼻咽癌細胞株均培養(yǎng)于含10%小牛血清的改良型RPMI-1640培養(yǎng)基,于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。2.平板克隆實驗：胰酶消化對數(shù)期生長的貼壁細胞后制成單細胞懸液,六孔板中每孔加入200個細胞,加入2m1含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基,待形成明顯的細胞集落時4%多聚甲醛固定15min,PBS清洗后蘇木素染色10min,觀察克隆數(shù)目及大小形態(tài)。3.Transwell遷移實驗：胰酶消化細胞后以無血清培養(yǎng)基洗滌細胞并制成細胞懸液(細胞數(shù)為5X104),加100u1無血清培養(yǎng)基重懸至transwell小室上腔,加入500u1完全培養(yǎng)基至1transwell小室下腔,于370C、5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18-22小時后取出,PBS洗滌后4%多聚甲醛固定10min,吉姆薩染色(A液1min,B液5min),PBS洗滌后晾干,用刀切下膜,中性樹脂封片,顯微鏡下計數(shù)穿膜細胞數(shù)。4.Transwell侵襲實驗：提前4h配置Matrigel基質(zhì)膠(24ug/孔,45u1/孔),胰酶消化細胞后以100ul無血清培養(yǎng)基重懸細胞(細胞數(shù)為5X104)加入transwell小室上腔的Matrigel基質(zhì)膠表面,transwell小室下腔加入500ul完全培養(yǎng)基作為趨化物。于37℃、5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)19-22h后,PBS洗滌后4%多聚甲醛固定10min,吉姆薩染色(A液1min,B液5min),PBS洗滌后晾干,用刀切下膜,中性樹脂封片,顯微鏡下計數(shù)穿膜細胞數(shù)。5.MTT檢測：將對數(shù)生長期的貼壁細胞消化重懸后接種到96孔板中,每孔10000個細胞,200u1培基,37。C,5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,依濃度梯度加入藥物。藥物作用24h后每孔加20μ1 MTT,繼續(xù)培養(yǎng)4h,將細胞培養(yǎng)液上清棄去,每孔加入150μ1DMSO,搖床混勻約10min。酶標儀490nm比色檢測,繪制腫瘤細胞生長曲線。6.腫瘤球培養(yǎng)實驗：無血清培養(yǎng)基配制：無血清培養(yǎng)基(serum free medium, SFM)由Ham's DMEM-F12(1:1)、雙抗 (1:100)、B27(1:50)、EGF(20ng/ml)、bFGF(20ng/ml)組成,將鼻咽癌CNE-2,5-8F細胞接種于10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中,待細胞處于對數(shù)生長期,用PBS液清洗,胰酶消化,消化后再用PBS清洗兩次,置于低吸附皿中,懸浮于SFM中進行培養(yǎng),5-7d后倒置顯微鏡觀察腫瘤球大小、形態(tài)和數(shù)量。7.側(cè)群細胞檢測：將貼壁細胞胰酶消化后分離成單個細胞,離心后用含2%胎牛血清的1640培基(37。C預(yù)熱)重懸,染色劑Hoechst33342標記,標記的細胞在37。C孵育箱孵育90min(避光,間斷搖晃),4。C低溫離心,PBS洗滌,重懸,檢測前加入Propidium Iodide標記死細胞,用流式細胞儀檢測側(cè)群細胞比例。8.提取蛋白、檢測蛋白濃度和免疫印跡檢測：配置裂解液,加入鋪有藥物作用24h的細胞中,在冰上作用30min后將蛋白掛下,4℃離心30min,取上清液,加入檢測蛋白的工作液200u1/孔,37℃孵育30min后,酶標儀490nm比色檢測,繪制標準蛋白曲線,將所有要檢測的樣品配平,根據(jù)分子量大小及所帶電荷,蛋白質(zhì)電泳分離,將電泳后分離的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上,PVDF膜浸泡在封閉液中室溫1h,一抗4-C孵育過夜,PVDF膜與二抗在室溫下孵育1h,化學(xué)發(fā)光法檢測。9.體內(nèi)成瘤實驗：40只3-4w的雌性裸鼠,體重約15-20g,進行裸鼠皮下成瘤實驗,裸鼠背部皮下接種2×106個細胞(細胞用100μl按1：1RPM-1640培基和Matrigel懸浮),待40只裸鼠腫瘤體積平均長到約100mm3左右,將荷瘤裸鼠隨機分為5組,分別為空白組、順鉑組和高、中、低濃度SangA組,空白組灌胃給與生理鹽水,每天一次；SangA組灌胃給與不同濃度SangA,每天一次；順鉑組腹腔注射給藥,每周一次。定期觀察腫瘤生長情況,記錄小鼠體重變化,根據(jù)公式V=1/2 ab2(a為腫瘤的最長徑,b為腫瘤的最短徑)計算腫瘤體積,繪制腫瘤成長曲線。觀察80天后處死老鼠,取出腫瘤組織,做HE染色。10..本課題所用統(tǒng)計學(xué)方法：所有數(shù)據(jù)均采用統(tǒng)計軟件SPSS 16.0對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)處理和分析,計量資料以均數(shù)±標準差(x±s)表示。各組裸鼠體重及腫瘤體積,抑制率,穿膜細胞數(shù),克隆形成率,腫瘤球形成率及直徑均采用單因素方差分析(One-way ANOVA)比較各組差異,如方差齊性,多重比較采用LSD法；如方差不齊,采用We l c h值,多重比較采用Dunnett T3法；在體腫瘤生長曲線的比較采用兩因素方差分析(two-way ANOVA)比較各組間差異。P0.05被認為有統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果1. SangA抑制鼻咽癌細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的作用(1)MTT檢測結(jié)果顯示,與對照組相比,一定濃度的SangA對CNE2、5-8F細胞的增殖具有顯著抑制作用(P0.05)；(2)與對照組相比,1.6mg/ml、0.8mg/ml的SangA作用CNE2、5-8F細胞后比DMSO體外增殖速度減慢(P=0.000)；(3)體外遷移實驗結(jié)果顯示,與對照組相比,1.6mg/ml、0.8mg/ml的SangA作用于CNE2、5-8F細胞后的遷移運動能力下降(P=0.000)；(4)體外侵襲實驗結(jié)果顯示,與對照組相比1.6mg/ml、0.8mg/ml的SangA作用于CNE2、5-8F細胞后的侵襲運動能力下降(P=0.000)。2.SangA抑制鼻咽癌腫瘤干細胞的作用(1) SangA處理組較DMSO組腫瘤球形成率低(P=0.000),腫瘤球直徑小(P=0.000)：(2)相對DMSO組,SangA處理組和Cisplatin處理組均可降低細胞SP；(3) SangA處理CNE-2細胞后beta-catenin、ABCG2、c-myc、Bmi-1蛋白表達降低,SangA處理5-8F細胞后beta-catenin、c-myc蛋白表達降低；(4) SangA高、中、低劑量組體重趨勢與對照組基本相似,與對照組無顯著性差異(P=0.998,0.956,1.0000.05),說明SangA高、中、低劑量對荷鼻咽癌裸鼠的體重?zé)o明顯影響。順鉑組則與對照組有顯著性差異(P=0.0170.05),說明順鉑顯著降低裸鼠的體重,表現(xiàn)出一定的毒副作用。與對照組相比,順鉑組(P=0.0110.05),SangA高、中劑量組(P=0.036,0.0410.05)能抑制腫瘤的生長,SangA低劑量組與對照組無顯著性差異(P=0.0680.05)。說明SangA在一定劑量下能顯著抑制腫瘤的生長,具有一定的抗腫瘤活性。(5)對照組裸鼠生存率為42.9%,順鉑組裸鼠生存率為57.1%,SangA高、低劑量組裸鼠生存率為85.7%,中劑量組為57.1%。對照組平均生存期為62.0天,中位生存期為57.0天；順鉑組平均生存期為59.7天,中位生存期80天。SangA高、中、低劑量組平均生存期分別為78.4天、76天、75.8天,中位生存期均80天。結(jié)果表明SangA對荷鼻咽癌裸鼠的生存期有一定的延長作用。結(jié)論1. SangA可抑制鼻咽癌細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移；2. SangA可選擇性抑制鼻咽癌腫瘤干細胞。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R739.63

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本文編號：2568795