【摘要】：研究背景鼻咽癌(]nasopharyngeal carcinoma, NPC)是我國(guó)南方高發(fā)的一種鼻咽部惡性上皮性腫瘤,由于鼻咽部位置隱蔽,患者早中期常無(wú)明顯不適癥狀,所以臨床早期診斷、可治療比例較低,確診的病例中70%已為中晚期,常伴有轉(zhuǎn)移,失去了最佳治療時(shí)期。臨床上治療主要采取放療為主,手術(shù)及化療為輔的方式進(jìn)行治療,化療一般采取以鉑類(lèi)化療藥為主的聯(lián)合放化療方案,雖然近幾十年,隨著整體醫(yī)療水平的提高,對(duì)鼻咽癌的早期診斷和治療手段有明顯提高,但五年生存率僅徘徊在50%-60%之間。復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移導(dǎo)致預(yù)后不良。因此,目前急切地需要尋找一種新的并且有效的方法來(lái)治療鼻咽癌。腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells, CSCs)研究是近年來(lái)生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的的一個(gè)研究熱點(diǎn),腫瘤干細(xì)胞的理念用于解釋腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性已經(jīng)很久了,隨著對(duì)腫瘤干細(xì)胞研究的進(jìn)一步深入,發(fā)現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞是腫瘤形成和耐藥的根本原因。腫瘤干細(xì)胞具有自我更新、無(wú)限增殖、分化、高致瘤性等特性,并且在腫瘤生成、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和耐藥等過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。鼻咽癌干細(xì)胞的研究是目前鼻咽癌研究領(lǐng)域的特點(diǎn),而且越來(lái)越多的研究表明在鼻咽癌中存在腫瘤干細(xì)胞,并且發(fā)現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞是鼻咽癌發(fā)生發(fā)展、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。因此,尋找一種能夠抑制或殺滅鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞的有效手段對(duì)成功治療鼻咽癌至關(guān)重要。因?yàn)槟[瘤干細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞中占的比例極少,而且體外培養(yǎng)時(shí),腫瘤干細(xì)胞迅速分裂增殖,不易進(jìn)行體外擴(kuò)增,因此體外大規(guī)模地培養(yǎng)腫瘤干細(xì)胞用于抗腫瘤干細(xì)胞藥物的篩選還未能實(shí)現(xiàn)。如何在體外獲得穩(wěn)定、富含腫瘤干細(xì)胞的細(xì)胞亞群是體外篩選抗腫瘤干細(xì)胞藥物的關(guān)鍵技術(shù)之一,也是我們首先要做的。目前腫瘤干細(xì)胞體外分離的常用方法有細(xì)胞表面分子標(biāo)志物分選法(一些細(xì)胞表面蛋白如CD44、CD133和胚胎干細(xì)胞標(biāo)記物已經(jīng)廣泛應(yīng)用于鑒定腫瘤干細(xì)胞)、側(cè)群細(xì)胞分選法(依賴(lài)ABCG2分子能將核特異性染料Hoechst 33342泵出細(xì)胞外,流式細(xì)胞儀檢測(cè)Hoechst染料陰性或弱陽(yáng)性的為SP細(xì)胞這個(gè)原理,目前已有實(shí)驗(yàn)證明SP細(xì)胞可應(yīng)用于鑒別和分選鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞)、無(wú)血清懸浮培養(yǎng)法(含EGF、bFGF、B27等生長(zhǎng)因子的無(wú)血清培養(yǎng)基可以使腫瘤干細(xì)胞在此條件下懸浮生長(zhǎng)和體外擴(kuò)增而不發(fā)生分化,因此通過(guò)無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)形成腫瘤細(xì)胞球可以用來(lái)富集腫瘤干細(xì)胞)、上皮間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化、PKH26標(biāo)記(一種親脂性的紅色熒光染料,可與細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙分子層不可逆結(jié)合,而腫瘤干細(xì)胞具有生長(zhǎng)周期長(zhǎng),常處于相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài),目前已有報(bào)道PKH26可標(biāo)記靜止期細(xì)胞,PKH26陽(yáng)性細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞性質(zhì),因此PKH26標(biāo)記可作為腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記)、 乙醛脫氫酶(乙醛脫氫酶催化乙醛氧化成羧酸,是一系列氧化各種脂肪族醛、芳香族醛為相應(yīng)酸的酶,在生物體內(nèi)外的代謝中扮演著重要角色,ALDHlhigh是乳腺癌、肺癌、頭頸部腫瘤、胰腺癌、宮頸癌、前列腺癌、肝癌、腸癌和膀胱癌腫瘤干細(xì)胞的分子標(biāo)記)等。當(dāng)前的觀(guān)點(diǎn)認(rèn)為常規(guī)化療藥物只能殺傷占腫瘤絕大部分的非腫瘤干細(xì)胞,而不能有效地殺傷腫瘤干細(xì)胞�；熕幬镆�?yàn)槠錄](méi)有選擇性、特異性,導(dǎo)致化療藥物在臨床使用時(shí)常常伴隨很大的副作用。因此,對(duì)腫瘤干細(xì)胞的深入研究,可以確認(rèn)特異性針對(duì)腫瘤干細(xì)胞的藥物,對(duì)于臨床上治療腫瘤很關(guān)鍵。桑葉是桑科桑屬植物桑(Morus alba L.)的葉子,性寒,味甘苦,具有疏散風(fēng)熱、清肺潤(rùn)燥、清肝明目之功效,是常用中藥之一,在全國(guó)各地有廣泛的種植�，F(xiàn)代藥理研究證明,桑葉除了具有降血糖、清除自由基、抗菌、抗病毒等藥理作用外,還具有抗腫瘤活性。主要報(bào)道了黃酮類(lèi)、生物堿類(lèi)等若干化合物單體,對(duì)增殖腫瘤細(xì)胞具有抑制作用,動(dòng)物在體評(píng)價(jià)較少,以腫瘤干細(xì)胞為靶點(diǎn)的活性成分研究尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本論文旨在研究桑葉提取物(SangA)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的影響,并在干細(xì)胞水平研究SangA對(duì)鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞活性的影響。本研究以常規(guī)化療藥物順鉑作為陽(yáng)性對(duì)照、水作為空白對(duì)照和DMSO作為溶劑對(duì)照,通過(guò)MTT、平板克隆、transwell侵襲、transwell遷移研究了桑葉提取物A(SangA)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的作用；通過(guò)側(cè)群分析、腫瘤球形成及裸鼠體內(nèi)成瘤等相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究了桑葉提取物A (SangA)和對(duì)鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞的作用。證明了桑葉提取物A(SangA)可以有效地抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移,以及有效地抑制鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞。研究目的1.檢測(cè)SangA抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移的作用2.從細(xì)胞和整體動(dòng)物兩個(gè)層面全面評(píng)價(jià)SangA的抗鼻咽癌干細(xì)胞活性。研究方法1.細(xì)胞和培養(yǎng)條件：本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室保存。人鼻咽癌細(xì)胞株均培養(yǎng)于含10%小牛血清的改良型RPMI-1640培養(yǎng)基,于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。2.平板克隆實(shí)驗(yàn)：胰酶消化對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的貼壁細(xì)胞后制成單細(xì)胞懸液,六孔板中每孔加入200個(gè)細(xì)胞,加入2m1含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基,待形成明顯的細(xì)胞集落時(shí)4%多聚甲醛固定15min,PBS清洗后蘇木素染色10min,觀(guān)察克隆數(shù)目及大小形態(tài)。3.Transwell遷移實(shí)驗(yàn)：胰酶消化細(xì)胞后以無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞并制成細(xì)胞懸液(細(xì)胞數(shù)為5X104),加100u1無(wú)血清培養(yǎng)基重懸至transwell小室上腔,加入500u1完全培養(yǎng)基至1transwell小室下腔,于370C、5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18-22小時(shí)后取出,PBS洗滌后4%多聚甲醛固定10min,吉姆薩染色(A液1min,B液5min),PBS洗滌后晾干,用刀切下膜,中性樹(shù)脂封片,顯微鏡下計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。4.Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)：提前4h配置Matrigel基質(zhì)膠(24ug/孔,45u1/孔),胰酶消化細(xì)胞后以100ul無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞(細(xì)胞數(shù)為5X104)加入transwell小室上腔的Matrigel基質(zhì)膠表面,transwell小室下腔加入500ul完全培養(yǎng)基作為趨化物。于37℃、5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)19-22h后,PBS洗滌后4%多聚甲醛固定10min,吉姆薩染色(A液1min,B液5min),PBS洗滌后晾干,用刀切下膜,中性樹(shù)脂封片,顯微鏡下計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。5.MTT檢測(cè)：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的貼壁細(xì)胞消化重懸后接種到96孔板中,每孔10000個(gè)細(xì)胞,200u1培基,37。C,5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,依濃度梯度加入藥物。藥物作用24h后每孔加20μ1 MTT,繼續(xù)培養(yǎng)4h,將細(xì)胞培養(yǎng)液上清棄去,每孔加入150μ1DMSO,搖床混勻約10min。酶標(biāo)儀490nm比色檢測(cè),繪制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)。6.腫瘤球培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)：無(wú)血清培養(yǎng)基配制：無(wú)血清培養(yǎng)基(serum free medium, SFM)由Ham's DMEM-F12(1:1)、雙抗 (1:100)、B27(1:50)、EGF(20ng/ml)、bFGF(20ng/ml)組成,將鼻咽癌CNE-2,5-8F細(xì)胞接種于10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中,待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,用PBS液清洗,胰酶消化,消化后再用PBS清洗兩次,置于低吸附皿中,懸浮于SFM中進(jìn)行培養(yǎng),5-7d后倒置顯微鏡觀(guān)察腫瘤球大小、形態(tài)和數(shù)量。7.側(cè)群細(xì)胞檢測(cè)：將貼壁細(xì)胞胰酶消化后分離成單個(gè)細(xì)胞,離心后用含2%胎牛血清的1640培基(37。C預(yù)熱)重懸,染色劑Hoechst33342標(biāo)記,標(biāo)記的細(xì)胞在37。C孵育箱孵育90min(避光,間斷搖晃),4。C低溫離心,PBS洗滌,重懸,檢測(cè)前加入Propidium Iodide標(biāo)記死細(xì)胞,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)側(cè)群細(xì)胞比例。8.提取蛋白、檢測(cè)蛋白濃度和免疫印跡檢測(cè)：配置裂解液,加入鋪有藥物作用24h的細(xì)胞中,在冰上作用30min后將蛋白掛下,4℃離心30min,取上清液,加入檢測(cè)蛋白的工作液200u1/孔,37℃孵育30min后,酶標(biāo)儀490nm比色檢測(cè),繪制標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線(xiàn),將所有要檢測(cè)的樣品配平,根據(jù)分子量大小及所帶電荷,蛋白質(zhì)電泳分離,將電泳后分離的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上,PVDF膜浸泡在封閉液中室溫1h,一抗4-C孵育過(guò)夜,PVDF膜與二抗在室溫下孵育1h,化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)。9.體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)：40只3-4w的雌性裸鼠,體重約15-20g,進(jìn)行裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn),裸鼠背部皮下接種2×106個(gè)細(xì)胞(細(xì)胞用100μl按1：1RPM-1640培基和Matrigel懸浮),待40只裸鼠腫瘤體積平均長(zhǎng)到約100mm3左右,將荷瘤裸鼠隨機(jī)分為5組,分別為空白組、順鉑組和高、中、低濃度SangA組,空白組灌胃給與生理鹽水,每天一次；SangA組灌胃給與不同濃度SangA,每天一次；順鉑組腹腔注射給藥,每周一次。定期觀(guān)察腫瘤生長(zhǎng)情況,記錄小鼠體重變化,根據(jù)公式V=1/2 ab2(a為腫瘤的最長(zhǎng)徑,b為腫瘤的最短徑)計(jì)算腫瘤體積,繪制腫瘤成長(zhǎng)曲線(xiàn)。觀(guān)察80天后處死老鼠,取出腫瘤組織,做HE染色。10..本課題所用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：所有數(shù)據(jù)均采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 16.0對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理和分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。各組裸鼠體重及腫瘤體積,抑制率,穿膜細(xì)胞數(shù),克隆形成率,腫瘤球形成率及直徑均采用單因素方差分析(One-way ANOVA)比較各組差異,如方差齊性,多重比較采用LSD法；如方差不齊,采用We l c h值,多重比較采用Dunnett T3法；在體腫瘤生長(zhǎng)曲線(xiàn)的比較采用兩因素方差分析(two-way ANOVA)比較各組間差異。P0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果1. SangA抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的作用(1)MTT檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,一定濃度的SangA對(duì)CNE2、5-8F細(xì)胞的增殖具有顯著抑制作用(P0.05)；(2)與對(duì)照組相比,1.6mg/ml、0.8mg/ml的SangA作用CNE2、5-8F細(xì)胞后比DMSO體外增殖速度減慢(P=0.000)；(3)體外遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,1.6mg/ml、0.8mg/ml的SangA作用于CNE2、5-8F細(xì)胞后的遷移運(yùn)動(dòng)能力下降(P=0.000)；(4)體外侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比1.6mg/ml、0.8mg/ml的SangA作用于CNE2、5-8F細(xì)胞后的侵襲運(yùn)動(dòng)能力下降(P=0.000)。2.SangA抑制鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞的作用(1) SangA處理組較DMSO組腫瘤球形成率低(P=0.000),腫瘤球直徑小(P=0.000)：(2)相對(duì)DMSO組,SangA處理組和Cisplatin處理組均可降低細(xì)胞SP；(3) SangA處理CNE-2細(xì)胞后beta-catenin、ABCG2、c-myc、Bmi-1蛋白表達(dá)降低,SangA處理5-8F細(xì)胞后beta-catenin、c-myc蛋白表達(dá)降低；(4) SangA高、中、低劑量組體重趨勢(shì)與對(duì)照組基本相似,與對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P=0.998,0.956,1.0000.05),說(shuō)明SangA高、中、低劑量對(duì)荷鼻咽癌裸鼠的體重?zé)o明顯影響。順鉑組則與對(duì)照組有顯著性差異(P=0.0170.05),說(shuō)明順鉑顯著降低裸鼠的體重,表現(xiàn)出一定的毒副作用。與對(duì)照組相比,順鉑組(P=0.0110.05),SangA高、中劑量組(P=0.036,0.0410.05)能抑制腫瘤的生長(zhǎng),SangA低劑量組與對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P=0.0680.05)。說(shuō)明SangA在一定劑量下能顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng),具有一定的抗腫瘤活性。(5)對(duì)照組裸鼠生存率為42.9%,順鉑組裸鼠生存率為57.1%,SangA高、低劑量組裸鼠生存率為85.7%,中劑量組為57.1%。對(duì)照組平均生存期為62.0天,中位生存期為57.0天；順鉑組平均生存期為59.7天,中位生存期80天。SangA高、中、低劑量組平均生存期分別為78.4天、76天、75.8天,中位生存期均80天。結(jié)果表明SangA對(duì)荷鼻咽癌裸鼠的生存期有一定的延長(zhǎng)作用。結(jié)論1. SangA可抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移；2. SangA可選擇性抑制鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R739.63

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10 高凡;化療或是癌癥復(fù)發(fā)根源[N];科學(xué)導(dǎo)報(bào);2009年

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1 楊孟選;荷載腫瘤干細(xì)胞抗原的樹(shù)突細(xì)胞疫苗聯(lián)合糖脂類(lèi)分子治療小鼠結(jié)腸癌的實(shí)驗(yàn)研究[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

2 林鋮;人miR-489靶向p38α誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬[D];浙江大學(xué);2015年

3 孫翠翠;雙聯(lián)芐類(lèi)化合物Riccardin D的抗腫瘤作用及機(jī)制研究[D];山東大學(xué);2015年

4 孫蓉;納米載體同步輸送藥物用于腫瘤干細(xì)胞治療的研究[D];中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué);2015年

5 趙志舉;miR-221對(duì)正常乳腺和乳腺腫瘤干細(xì)胞調(diào)控的研究[D];中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué);2015年

6 蔡啟亮;CD44+腫瘤干/祖細(xì)胞在前列腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用和機(jī)制研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2015年

7 王雪琴;基于超順磁性納米顆粒的腫瘤干細(xì)胞生物學(xué)特性研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2012年

8 趙海鋒;兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)腫瘤局部免疫功能影響的實(shí)驗(yàn)研究[D];山東大學(xué);2008年

9 李鋒;腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物檢測(cè)對(duì)Ⅰ期肺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)價(jià)值及機(jī)制學(xué)研究[D];浙江大學(xué);2011年

10 王曉峰;基于CD133/Prominin 1基因啟動(dòng)子活性分選腫瘤干細(xì)胞的研究[D];吉林大學(xué);2012年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 邱暢;CD44聯(lián)合Prpc作為胃癌干細(xì)胞的初步研究[D];中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院;2015年

2 何文婷;載索拉非尼及蘿卜硫素介孔二氧化硅脂質(zhì)納米粒聯(lián)用體外抗腫瘤細(xì)胞與腫瘤干細(xì)胞作用研究[D];福建中醫(yī)藥大學(xué);2015年

3 毛驍麗;穿膜肽聯(lián)合鹽霉素磷脂膠束靶向腫瘤干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究[D];福建中醫(yī)藥大學(xué);2015年

4 王喜隆;~1H-MVS參數(shù)Cho/Cr與腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物關(guān)系研究[D];寧夏醫(yī)科大學(xué);2015年

5 譚燦亮;人甲狀腺癌中腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定[D];南方醫(yī)科大學(xué);2015年

6 洪少馥;超聲輻照聯(lián)合紫杉醇對(duì)三維腫瘤球細(xì)胞毒性效果評(píng)價(jià)及其機(jī)制的研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2015年

7 張成龍;利用CD133~+腫瘤表面標(biāo)記物分離、鑒定和培養(yǎng)胃癌腫瘤干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究[D];昆明醫(yī)科大學(xué);2015年

8 尹曉龍;卵巢癌腫瘤干細(xì)胞的研究進(jìn)展[D];蚌埠醫(yī)學(xué)院;2015年

9 劉觀(guān)成;鼻咽癌中腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)研究[D];桂林醫(yī)學(xué)院;2015年

10 徐望;5-氟尿嘧啶對(duì)人舌鱗癌Tca8113中腫瘤干細(xì)胞富集作用[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2015年

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本文編號(hào)：2568795