【摘要】：目的：探討氧自由基聚集對體外培養(yǎng)的螺旋神經(jīng)節(jié)細胞的損傷機制及其與衰老和DNA甲基化的關系。 方法：取出生后2—3天的SD乳鼠耳蝸,精細分離出Rosenthal管,建立螺旋神經(jīng)節(jié)細胞(SGN)的體外培養(yǎng)模型,并對培養(yǎng)的SGN進行光鏡下觀察及免疫熒光鑒定。將SGN分為三個組：對照組為體外培養(yǎng)9天的SGN；D-半乳糖(D-gal)組為自然培養(yǎng)4天后用含D-gal的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)5天；自然衰老組為體外正常培養(yǎng)30天的SGN。通過CCK8檢測篩選D-gal的作用濃度,流式檢測技術檢測細胞內的ROS水平,RT-PCR檢測mtDNA4834缺失突變率,β-半乳糖苷酶染色法觀察對照組、D-gal組和自然衰老組的SGN衰老染色程度,激光共聚焦顯微鏡下觀察Dnmtl,TFAM,NRF1在螺旋神經(jīng)節(jié)細胞內的表達及定位,RT-PCR檢測Dnmtl,PGC-1α,BDNF mRNA在對照組、D-gal組和自然衰老組的表達水平。 結果：純化后的螺旋神經(jīng)節(jié)細胞NF200及NeuN染色陽性,部分SGN TUJ1染色陽性。CCK8檢測示D-gal在25mg/ml作用24h對SGN細胞增殖率的影響與對照組相比具有統(tǒng)計學差異(P0.05),而滲透壓對照組D-葡萄糖和甘露醇分別在30mg/ml和35mg/ml時對SGN增殖率的影響具有統(tǒng)計學差異。20mg/ml的D-gal作用5天后螺旋神經(jīng)節(jié)細胞ROS水平較對照組升高約20%,差異具有統(tǒng)計學意義。D-gal組和自然衰老組與對照組相比mtDNA4834缺失突變率變化無統(tǒng)計學差異。隨著培養(yǎng)時間的延長,SGN β-半乳糖苷酶染色程度逐漸加深,而D-gal組和對照組之間的差異并不顯著。DNMT1和PGC-1α在D-gal和自然衰老組轉錄水平上與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義,而BDNF在D-gal組和自然衰老組其mRNA水平較對照組均明顯上升。 結論：20mg/mlD-半乳糖可以誘導螺旋神經(jīng)節(jié)細胞內ROS水平升高,但螺旋神經(jīng)節(jié)細胞并未出現(xiàn)加速衰老的現(xiàn)象。與調節(jié)線粒體功轉錄功能相關的PGC-1α及與維持DNA甲基化水平相關的DNMT1在mRNA水平也并未出現(xiàn)明顯變化。結合前期D-半乳糖所誘導的大鼠擬老化模型及邊緣細胞的體外衰老模型,D-半乳糖可能更適合建立一種代謝性耳聾模型。要建立螺旋神經(jīng)節(jié)細胞的體外加速衰老模型,我們需要尋找新的方法。
【圖文】：

華中科技大學博士學位論文6 D-gal濃度：20mg/ml.D-gal組3 -半乳糖苷酶染色程度與對照組相比差異顯著。而自然衰老組與對照組相比，，￠-半乳糖苷酶染色則明顯加深.、 Dnmtl , NRF1 ,Tfam免疫焚光染色
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R764.43

【參考文獻】

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1 孔維佳;胡鈺娟;王瓊;許黎;王瑩;韓月臣;李雋;劉波;孔雯;;大鼠內耳擬老化伴線粒體突變模型的建立[J];臨床耳鼻咽喉科雜志;2006年19期

2 邢玉芝;楊玲麟;林洪;胡火珍;王有為;;D-半乳糖對大鼠骨髓間充質干細胞擬衰老作用的實驗研究[J];中國修復重建外科雜志;2006年04期

本文編號：2566746