發(fā)布時(shí)間：2019-11-27 20:11

【摘要】：目的：探討氧自由基聚集對(duì)體外培養(yǎng)的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的損傷機(jī)制及其與衰老和DNA甲基化的關(guān)系。 方法：取出生后2—3天的SD乳鼠耳蝸,精細(xì)分離出Rosenthal管,建立螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(SGN)的體外培養(yǎng)模型,并對(duì)培養(yǎng)的SGN進(jìn)行光鏡下觀察及免疫熒光鑒定。將SGN分為三個(gè)組：對(duì)照組為體外培養(yǎng)9天的SGN；D-半乳糖(D-gal)組為自然培養(yǎng)4天后用含D-gal的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)5天；自然衰老組為體外正常培養(yǎng)30天的SGN。通過(guò)CCK8檢測(cè)篩選D-gal的作用濃度,流式檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的ROS水平,RT-PCR檢測(cè)mtDNA4834缺失突變率,β-半乳糖苷酶染色法觀察對(duì)照組、D-gal組和自然衰老組的SGN衰老染色程度,激光共聚焦顯微鏡下觀察Dnmtl,TFAM,NRF1在螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)及定位,RT-PCR檢測(cè)Dnmtl,PGC-1α,BDNF mRNA在對(duì)照組、D-gal組和自然衰老組的表達(dá)水平。 結(jié)果：純化后的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞NF200及NeuN染色陽(yáng)性,部分SGN TUJ1染色陽(yáng)性。CCK8檢測(cè)示D-gal在25mg/ml作用24h對(duì)SGN細(xì)胞增殖率的影響與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),而滲透壓對(duì)照組D-葡萄糖和甘露醇分別在30mg/ml和35mg/ml時(shí)對(duì)SGN增殖率的影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。20mg/ml的D-gal作用5天后螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞ROS水平較對(duì)照組升高約20%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。D-gal組和自然衰老組與對(duì)照組相比mtDNA4834缺失突變率變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),SGN β-半乳糖苷酶染色程度逐漸加深,而D-gal組和對(duì)照組之間的差異并不顯著。DNMT1和PGC-1α在D-gal和自然衰老組轉(zhuǎn)錄水平上與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而B(niǎo)DNF在D-gal組和自然衰老組其mRNA水平較對(duì)照組均明顯上升。 結(jié)論：20mg/mlD-半乳糖可以誘導(dǎo)螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高,但螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞并未出現(xiàn)加速衰老的現(xiàn)象。與調(diào)節(jié)線粒體功轉(zhuǎn)錄功能相關(guān)的PGC-1α及與維持DNA甲基化水平相關(guān)的DNMT1在mRNA水平也并未出現(xiàn)明顯變化。結(jié)合前期D-半乳糖所誘導(dǎo)的大鼠擬老化模型及邊緣細(xì)胞的體外衰老模型,D-半乳糖可能更適合建立一種代謝性耳聾模型。要建立螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的體外加速衰老模型,我們需要尋找新的方法。
【圖文】：

華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文6 D-gal濃度：20mg/ml.D-gal組3 -半乳糖苷酶染色程度與對(duì)照組相比差異顯著。而自然衰老組與對(duì)照組相比，，￠-半乳糖苷酶染色則明顯加深.、 Dnmtl , NRF1 ,Tfam免疫焚光染色
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R764.43

【參考文獻(xiàn)】

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1 孔維佳;胡鈺娟;王瓊;許黎;王瑩;韓月臣;李雋;劉波;孔雯;;大鼠內(nèi)耳擬老化伴線粒體突變模型的建立[J];臨床耳鼻咽喉科雜志;2006年19期

2 邢玉芝;楊玲麟;林洪;胡火珍;王有為;;D-半乳糖對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞擬衰老作用的實(shí)驗(yàn)研究[J];中國(guó)修復(fù)重建外科雜志;2006年04期

本文編號(hào)：2566746