【摘要】： 在成年哺乳動(dòng)物耳蝸中,聽(tīng)覺(jué)毛細(xì)胞和神經(jīng)元損傷后不能再生,這成為感音神經(jīng)性聾難以治愈的主要原因。近年來(lái),自新生鼠耳蝸分離出前體細(xì)胞,在體外可定向分化為表達(dá)毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)元表型的細(xì)胞。我們?cè)隗w外比較了P1、P7和P14的大鼠耳蝸前體細(xì)胞的數(shù)量、增殖能力及超微結(jié)構(gòu),結(jié)果表明出生后耳蝸前體細(xì)胞大部分處于細(xì)胞周期的靜止期,并逐步通過(guò)分化和凋亡徹底地退出了細(xì)胞周期,耳蝸前體細(xì)胞也并非真正意義上的干細(xì)胞,而是處于干細(xì)胞與成熟子代細(xì)胞之間的中間細(xì)胞或是處于干細(xì)胞未端的細(xì)胞。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)c-Myc可能參與調(diào)控耳蝸的發(fā)育以及前體細(xì)胞的增殖、分化。結(jié)合之前的工作基礎(chǔ),我們利用腺病毒技術(shù)將c-Myc和cyclin A2共轉(zhuǎn)染至新生鼠耳蝸前體細(xì)胞,可使其增殖,并促進(jìn)前體細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期。初步研究其調(diào)控機(jī)制,表明為經(jīng)典的CKI-cyclin-CDK途徑。 實(shí)驗(yàn)一大鼠耳蝸前體細(xì)胞的分離、培養(yǎng) 目的對(duì)新生大鼠耳蝸前體細(xì)胞進(jìn)行分離、培養(yǎng)。 方法從P7大鼠耳蝸中分離、培養(yǎng)前體細(xì)胞,用免疫細(xì)胞化學(xué)的方法對(duì)前體細(xì)胞進(jìn)行鑒定;血清誘導(dǎo)分化后鑒定分化潛能,進(jìn)一步了解其多向分化特性。 結(jié)果原代培養(yǎng)的細(xì)胞,培養(yǎng)1天后即可見(jiàn)“細(xì)胞球”,隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加,可見(jiàn)細(xì)胞球體積增大,所含細(xì)胞增多;培養(yǎng)5天后,少部分細(xì)胞球內(nèi)的細(xì)胞出現(xiàn)分化及貼壁現(xiàn)象。細(xì)胞球內(nèi)大部分細(xì)胞呈nestin、musashi1和BrdU陽(yáng)性,表明其具有自我更新及有絲分裂的能力。細(xì)胞球經(jīng)誘導(dǎo)分化14 d后,對(duì)分化細(xì)胞行免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定,發(fā)現(xiàn)分化細(xì)胞表達(dá)毛細(xì)胞標(biāo)志物myosin VIIA和phalloidin,表達(dá)成熟神經(jīng)元標(biāo)志物NeuN,表達(dá)不成熟神經(jīng)元標(biāo)志物Tuj1,表達(dá)星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP,表達(dá)少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物galactocerebroside,以及谷氨酸能神經(jīng)元標(biāo)志物GluR-1,證明其具有多向分化潛能。 結(jié)論本部分實(shí)驗(yàn)為研究耳蝸前體細(xì)胞成年后“沉默”的機(jī)制奠定基礎(chǔ),為研究通過(guò)基因治療的方法促進(jìn)前體細(xì)胞增殖提供了一種體外模型。 實(shí)驗(yàn)二不同日齡大鼠耳蝸前體細(xì)胞增殖能力及超微結(jié)構(gòu)的比較 目的耳蝸前體細(xì)胞在成年后沉默或消失的具體機(jī)制尚不清楚,為探討其原因,我們?cè)隗w外比較了P1、P7和P14的大鼠耳蝸前體細(xì)胞的數(shù)量、增殖能力及超微結(jié)構(gòu),觀察耳蝸前體細(xì)胞的轉(zhuǎn)歸。 方法對(duì)P1、P7和P14分離出的耳蝸前體細(xì)胞,經(jīng)體外培養(yǎng)7天后進(jìn)行計(jì)數(shù),檢測(cè)其數(shù)量變化,并每隔5天傳代觀察傳代數(shù);采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期,來(lái)評(píng)估不同日齡新生大鼠耳蝸前體細(xì)胞增殖能力的變化;應(yīng)用透射電鏡觀察不同日齡新生大鼠耳蝸前體細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。 結(jié)果出生1周后耳蝸前體細(xì)胞的數(shù)量急劇下降,出生2周后的耳蝸內(nèi)未能分離出前體細(xì)胞;P7前體細(xì)胞的傳代數(shù)較P1減少;P7較P1更多的前體細(xì)胞處于有絲分裂的靜止期,增殖指數(shù)下降;P7的前體細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)中有更多分化細(xì)胞的特點(diǎn)。 結(jié)論耳蝸前體細(xì)胞出生后大部分處于細(xì)胞周期的靜止期,并逐步通過(guò)分化和凋亡徹底地退出了細(xì)胞周期,他們并非真正意義上的干細(xì)胞,而是處于干細(xì)胞與成熟子代細(xì)胞之間的中間細(xì)胞或是處于干細(xì)胞未端的細(xì)胞。 實(shí)驗(yàn)三c-Myc在大鼠耳蝸組織發(fā)育和耳蝸前體細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)變化 目的原癌基因c-Myc具有調(diào)控G0/G1轉(zhuǎn)換和去分化的雙重作用。目前對(duì)于c-Myc在內(nèi)耳中的功能尚未見(jiàn)報(bào)道。我們擬通過(guò)檢測(cè)c-Myc在大鼠耳蝸組織發(fā)育及前體細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)情況,探討其在哺乳動(dòng)物耳蝸發(fā)育中的作用。 方法1、取E10、E15、P1、P7和P14的SD大鼠耳蝸組織,應(yīng)用RT-PCR、Western blot的方法檢測(cè)c-Myc在大鼠耳蝸組織發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)情況。2、取耳蝸前體細(xì)胞和分化7天后的分化細(xì)胞,用RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)染色和Western blot的方法檢測(cè)c-Myc在耳蝸前體細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)情況。結(jié)果從胚胎至出生后的耳蝸發(fā)育過(guò)程中,c-Myc表達(dá)量呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì);在前體細(xì)胞的分化過(guò)程中c-Myc的表達(dá)量也呈現(xiàn)下降。 結(jié)論c-Myc的表達(dá)量在大鼠耳蝸組織發(fā)育及耳蝸前體細(xì)胞分化的過(guò)程中逐漸下降,這表明c-Myc可能參與調(diào)控大鼠耳蝸組織的發(fā)育及前體細(xì)胞的分化。 實(shí)驗(yàn)四Ad-c-Myc-EGFP和Ad-CyclinA2-EGFP的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染耳蝸前體細(xì)胞的濃度確定 目的構(gòu)建目的基因分別為c-Myc和CyclinA2的腺病毒載體,體外轉(zhuǎn)染大鼠耳蝸前體細(xì)胞,觀察轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞活性,確定適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)染濃度。方法1、構(gòu)建復(fù)制缺陷重組腺病毒: Ad-CyclinA2-EGFP、Ad-c-Myc-EGFP及Ad-EGFP;2、在不同效靶比濃度下(MOI=50、100、150、200、250),Ad-EGFP轉(zhuǎn)染耳蝸前體細(xì)胞,觀察不同濃度轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞形態(tài)變化,熒光顯微鏡觀察EGFP表達(dá)情況,計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分率;3、應(yīng)用MTT觀察細(xì)胞活性確定增殖點(diǎn);4、確定MOI值,應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。 結(jié)果毒種上清液經(jīng)PCR鑒定,能夠特異地?cái)U(kuò)增出預(yù)期大小的條帶,證明該重組腺病毒攜帶目的片段。在不同效靶比濃度下,EGFP陽(yáng)性細(xì)胞百分率隨MOI值的升高而增大;當(dāng)MOI=50,100,150時(shí)重組腺病毒對(duì)細(xì)胞的毒性作用與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異;當(dāng)MOI值=200時(shí),細(xì)胞狀態(tài)不佳,出現(xiàn)生長(zhǎng)抑制。根據(jù)光鏡下細(xì)胞形態(tài)學(xué)證據(jù),確定本實(shí)驗(yàn)采用MOI值為150。經(jīng)MTT法測(cè)定,細(xì)胞生長(zhǎng)曲線呈S形,轉(zhuǎn)染后36小時(shí)做為增殖點(diǎn),應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率為25.2%。 結(jié)論復(fù)制缺陷型腺病毒可有效轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的耳蝸前體細(xì)胞,為進(jìn)一步研究c-Myc和CyclinA2基因?qū)Χ伹绑w細(xì)胞增殖能力的影響奠定了基礎(chǔ)。 實(shí)驗(yàn)五c-Myc、CyclinA2基因?qū)Χ伹绑w細(xì)胞增殖能力的影響 目的耳蝸前體細(xì)胞在體外具有一定的增殖能力,可定向分化為表達(dá)毛細(xì)胞和神經(jīng)元表型的細(xì)胞,但耳蝸前體細(xì)胞增殖能力差,并處于細(xì)胞周期的“靜止”狀態(tài)。我們用編碼目的基因?yàn)閏-Myc和CyclinA2的腺病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染耳蝸前體細(xì)胞,促進(jìn)其增殖并重返細(xì)胞周期,從而為誘導(dǎo)耳蝸受損細(xì)胞再生提供新的思路和依據(jù)。 方法分別設(shè)立Ad-CyclinA2-EGFP轉(zhuǎn)染組、Ad-c-Myc-EGFP轉(zhuǎn)染組、Ad-EGFP轉(zhuǎn)染組及Ad-CyclinA2-EGFP、Ad-c-Myc-EGFP共轉(zhuǎn)染組;用復(fù)制缺陷腺病毒轉(zhuǎn)染大鼠耳蝸前體細(xì)胞,MOI值為150,用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)c-Myc和CyclinA2基因?qū)Χ伹绑w細(xì)胞周期的影響;BrdU孵育觀察轉(zhuǎn)染后有絲分裂能力的變化;觀察各組傳代能力變化,采用方差分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。 結(jié)果流式結(jié)果表明Ad-CyclinA2-EGFP轉(zhuǎn)染組、Ad-c-Myc-EGFP轉(zhuǎn)染組、Ad-EGFP轉(zhuǎn)染組對(duì)耳蝸前體細(xì)胞周期無(wú)明顯影響;而Ad-CyclinA2-EGFP、Ad-c-Myc-EGFP共轉(zhuǎn)染組可使部分耳蝸前體細(xì)胞進(jìn)入G1/S期和G2/M期,共轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組G0/G1期細(xì)胞比例分別為62.03±2.02%、78.27±6.09%(P㩳0.05);增殖指數(shù)分別為37.97±2.015、20.41±7.16(P㩳0.05)。共轉(zhuǎn)染組中共表達(dá)綠色熒光(EGFP)、紅色熒光(BrdU陽(yáng)性)及藍(lán)色熒光(Hoechst)的細(xì)胞球數(shù)量增多,表明共轉(zhuǎn)染c-Myc、CyclinA2使更多的耳蝸前體細(xì)胞具有有絲分裂的能力;各組間傳代能力無(wú)明顯變化。 結(jié)論c-Myc基因和CyclinA2基因單獨(dú)作用于耳蝸前體細(xì)胞,在體外對(duì)細(xì)胞增殖與細(xì)胞周期無(wú)明顯影響。而c-Myc和CyclinA2基因共同作用于耳蝸前體細(xì)胞,可促進(jìn)細(xì)胞增殖,使部分前體細(xì)胞重返細(xì)胞周期。 實(shí)驗(yàn)六c-Myc與CyclinA2基因促進(jìn)耳蝸前體細(xì)胞增殖的作用機(jī)制 目的研究c-Myc和CyclinA2基因共同轉(zhuǎn)染耳蝸前體細(xì)胞后,檢測(cè)目的基因表達(dá)情況以及促進(jìn)細(xì)胞增殖的機(jī)制。 方法應(yīng)用real-time PCR和Western blot的方法觀察轉(zhuǎn)染Ad-EGFP與共轉(zhuǎn)染Ad-CyclinA2-EGFP、Ad-c-Myc-EGFP時(shí)目的基因、PCNA、CDK2以及P27KIP1在細(xì)胞中的表達(dá)水平變化。 結(jié)果real-time PCR和Western blot結(jié)果證實(shí)攜帶目的基因的腺病毒轉(zhuǎn)染耳蝸前體細(xì)胞后能有效表達(dá)出相應(yīng)的mRNA和蛋白;并可升高PCNA與CDK2的表達(dá)水平,降低P27KIP1的表達(dá)水平。 結(jié)論復(fù)制缺陷型腺病毒可有效介導(dǎo)c-Myc和CyclinA2基因轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的耳蝸前體細(xì)胞,并通過(guò)上調(diào)細(xì)胞周期蛋白依賴激酶CDK2,下調(diào)CDK抑制蛋白P27KIP1,進(jìn)而上調(diào)細(xì)胞DNA合成期標(biāo)志蛋白PCNA來(lái)實(shí)現(xiàn)耳蝸前體細(xì)胞增殖的作用,其作用機(jī)制為經(jīng)典的CKI-cyclin-CDK途徑。
【圖文】：

圖 2.毛細(xì)胞，我們利用非感覺(jué)細(xì)胞通過(guò)有絲分裂分有絲分裂轉(zhuǎn)分化為新生毛細(xì)胞。不成熟細(xì)胞是胞分化的能力，他們可能來(lái)自大小上皮嵴。而前體的較好的候選細(xì)胞，他們能通過(guò)轉(zhuǎn)分化再生也被作為一種良好的選擇。前庭前體細(xì)胞特點(diǎn)是他們有自我更新的能力并且可分化成為細(xì)胞從成體組織中也被分離認(rèn)證。Li等[18, 19]從細(xì)胞特點(diǎn)的細(xì)胞，急性分離后，這些細(xì)胞增殖體外培養(yǎng)8天后，這些細(xì)胞nestin表達(dá)陽(yáng)性。Ne細(xì)胞和發(fā)育早期及出生后早期外周、中樞神經(jīng)[21]

-56-圖 1 P1、P7 和 P14 新生 SD 大鼠耳蝸前體細(xì)胞在培養(yǎng) 7 天后進(jìn)行細(xì)胞及細(xì)胞球計(jì)數(shù)，細(xì)胞數(shù)/耳蝸，，細(xì)胞球數(shù)/104cells。結(jié)果來(lái)自三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R764

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7 王偉;1、K_v7/KCNQ通道功能性地表達(dá)于寡突膠質(zhì)前體細(xì)胞2、Pirt分子對(duì)P2X_3受體電流的影響及機(jī)制研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2012年

8 朱寒陽(yáng);補(bǔ)肺通絡(luò)解毒法對(duì)小鼠Lewis肺癌P53和C-myc蛋白分子表達(dá)的影響[D];湖北中醫(yī)藥大學(xué);2011年

9 孫潔;反義c-myc基因轉(zhuǎn)染抑制后發(fā)性白內(nèi)障的實(shí)驗(yàn)研究[D];青島大學(xué);2004年

10 于雷;癌基因c-Myc、Kras及Notch2與輻射誘發(fā)胸腺淋巴瘤的相關(guān)研究[D];吉林大學(xué);2010年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 鄧志華;苦參素對(duì)人肝癌細(xì)胞株Bel-7404細(xì)胞增殖和E2F1、c-myc表達(dá)的影響[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2011年

2 辛小川;75例兒童淋巴瘤臨床病理分析及EB病毒感染、c-myc基因改變的相關(guān)性研究[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2010年

3 蔡貴陽(yáng);膀胱尿路上皮癌中C-myc, FBP1及FIR的表達(dá)及臨床意義[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2010年

4 嚴(yán)曉梅;MiRNAlet7、Ras、HMGA2、C-myc在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及臨床病理學(xué)意義[D];蘇州大學(xué);2010年

5 杜海爽;Notch1、c-myc及p21在乳腺癌中的表達(dá)及冬凌草甲素對(duì)乳腺癌Bcap-37細(xì)胞的作用研究[D];蘇州大學(xué);2010年

6 劉赫;FBP1和C-MYC在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2010年

7 甘偉;MiR143和C-Myc在直腸腺癌中的表達(dá)及意義[D];中南大學(xué);2010年

8 張巧琳;HepaCAM通過(guò)調(diào)節(jié)c-Myc抑制腎癌增殖[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2011年

9 邢寶春;p53、c-myc基因蛋白及PCNA在食管癌及癌前病變中的表達(dá)及意義[D];山西醫(yī)科大學(xué);2004年

10 秦紅霞;人口腔黏膜白斑及鱗狀細(xì)胞癌中c-Myc蛋白、hTERT、Survivin和Caspase-3表達(dá)的研究[D];鄭州大學(xué);2004年

本文編號(hào)：2565332