發(fā)布時間：2019-11-16 01:12

【摘要】：一、中國人群遺傳性視網(wǎng)膜疾病基因診斷平臺的建立目的分析26個中國人群遺傳性視網(wǎng)膜疾病(Hereditary retinal diseases,HRDs)家系的臨床特征,探討其遺傳學基礎(chǔ),初步建立HRDs基因診斷平臺。方法對參與研究的所有家系成員進行詳細的眼科檢查。選擇美國Roche公司的2.1 MNimbleGen序列捕獲芯片,目標區(qū)域覆蓋179個已知HRDs發(fā)病相關(guān)基因和10個預測剪接基因的所有外顯子區(qū)域。結(jié)合新一代測序技術(shù)(Next-generation sequencing,NGS)對收集的26個多種臨床表型的HRDs家系進行目標區(qū)域捕獲測序,數(shù)據(jù)經(jīng)分析濾過,獲得候選突變進行Sanger直接測序驗證和致病性評估。結(jié)果NGS數(shù)據(jù)經(jīng)分析濾過、Sanger直接測序驗證和致病性評估后,明確4個已知突變,2個復合突變和9個新突變。9個新突變中5個為嚴重的無義或移碼突變,4個為錯義突變。26個HRDs家系中有15個家系明確致病突變,檢出率為57.7%。其中一個位于VCAN基因的已知剪接位點突變,有力解釋了其相應(yīng)家系的復雜臨床表型,幫助確診為Wagner綜合征。剩余家系中,有5個家系獲得11個候選可能致病突變。結(jié)論HRDs具有顯著的遺傳和臨床異質(zhì)性,大量的潛在新致病基因和致病突變有待發(fā)現(xiàn)。本研究證實結(jié)合NGS技術(shù)的目標區(qū)域捕獲測序,能夠經(jīng)濟有效地檢測臨床表型多樣化的HRDs病例,更好地解釋疾病基因型與表型之間的關(guān)系,初步建立中國人群HRDs基因診斷平臺。二、常染色體顯性視網(wǎng)膜色素變性家系視紫紅質(zhì)基因的研究目的探討兩個位于視紫紅質(zhì)(Rhodopsin,RHO)基因的雜合錯義突變引起常染色體顯性遺傳視網(wǎng)膜色素變性(Autosomal dominant retinitis pigmentosa,adRP)的細胞學機制。方法選擇帶有綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)的真核質(zhì)粒載體pEGFP-N1,利用重疊PCR法構(gòu)建RHO~(WT)野生型,RHO~(L95P)和RHO~(P53R)兩種突變型質(zhì)粒。將3種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人視網(wǎng)膜色素上皮細胞系(ARPE 19)和人腎胚293細胞系(HEK293),觀察3種類型視紫紅質(zhì)-GFP融合蛋白在細胞內(nèi)的定位;采用蛋白印跡法(Western blot)檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)關(guān)鍵因子X盒結(jié)合蛋白1(X box-binding protein-1,XBP1)的表達。結(jié)果 3種類型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ARPE 19細胞24小時,細胞免疫熒光(Immunofluorescence,IF)顯示,與野生型相比,兩種突變型視紫紅質(zhì)-GFP融合蛋白均積聚在紅色的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上,不能有效向細胞膜轉(zhuǎn)運。此外,與轉(zhuǎn)染RHO~(WT)野生型細胞相比,轉(zhuǎn)染RHO~(L95P)和RHO~(P53R)兩種突變型質(zhì)粒的HEK293細胞中,XBP1在信使核糖核酸(Messenger ribonucleic acid,mRNA)水平均被特異性剪切26個堿基的內(nèi)含子,發(fā)生活化,且XBP1蛋白水平表達高于轉(zhuǎn)染野生型、轉(zhuǎn)染空pEGFP-Nl質(zhì)粒細胞及未轉(zhuǎn)染細胞。結(jié)論 RHO p.L95P和RHO p.P53R均屬于Ⅱ類突變,該突變類型的視紫紅質(zhì)蛋白不能有效地從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向細胞膜轉(zhuǎn)運,蓄積在內(nèi)質(zhì)網(wǎng),引起蛋白折疊錯誤,發(fā)生 ERS。第三部分:一個復雜表型中國漢族HRD家系的純合定位目的分析一個具有復雜眼部表型的中國漢族HRD家系的臨床特點,確定其遺傳學基礎(chǔ),探討基因型與表型之間的關(guān)系。方法對參與研究的所有家系成員進行詳細的眼科檢查。利用NGS技術(shù)對該家系先證者進行189-目標捕獲芯片的目標區(qū)域捕獲測序,數(shù)據(jù)經(jīng)分析濾過,候選突變進行Sanger直接測序驗證和致病性評估。在獲得一個位于BEST1基因上的可能致病突變后,對該家系進行11號染色體的純合定位,以期明確在純合區(qū)域內(nèi)是否尚存其他致病基因與該家系的復雜表型相關(guān)。結(jié)果數(shù)據(jù)經(jīng)分析濾過后獲得唯一可能致病突變BEST1c.752GA(p.C251Y),Sanger直接測序驗證該錯義突變在該家系中呈共分離。所有的5例患者均為純合子,臨床表型基本一致,眼底呈現(xiàn)典型常染色體隱性BEST病(Autosomal-recessive bestrophinopathy,ARB)樣黃斑病變,同時有閉角型青光眼(Angle-closure glaucoma,ACG)和白內(nèi)障,而雜合子攜帶者表型正常。251號氨基酸位于Bestrophin-1蛋白第5跨膜螺旋結(jié)構(gòu)內(nèi),在哺乳動物中高度保守。11號染色體的純合定位顯示該家系所有患者共享包括BEST1p.C251Y點突變在內(nèi)的純合區(qū)域,Sanger直接測序位于此區(qū)域內(nèi)的另外兩個與HRDs發(fā)病相關(guān)基因,未發(fā)現(xiàn)致病突變。結(jié)論BEST1P.C251Y很可能是該HRD家系的致病突變,11號染色體上包括BEST1 p.C251Y點突變在內(nèi)的純合區(qū)域與該家系臨床表型相關(guān),所有患者均表現(xiàn)為ARB、ACG和白內(nèi)障。結(jié)合NGS技術(shù)的目標區(qū)域捕獲測序,能夠經(jīng)濟有效地檢測臨床表型復雜的HRD病例,協(xié)助臨床診斷與治療。
【圖文】：

邐天津醫(yī)科大學博±學位論文邐逡逑異性探針，雜交探針長度２５０？３００邋ｂｐ，覆蓋１８９個基因的４，６４１個外顯子，，包括逡逑外顯子和內(nèi)含子拼接處１００邋ｂｐ和５’、３’非編碼區(qū)域（Ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ邋ｒｅｇｉｏｎｓ，邋ＵＴＲ），逡逑不包括重復序列，避免捕獲假基因，該目標區(qū)域捕獲芯片命名為：１８９－目標捕獲逡逑花片（圖２）。結(jié)合Ｉｌｌｕｍｉｎａ邋Ｓｏｌｅｘａ測序平臺的最新高通量測序儀Ｉｌｌｕｍｉｎａ邋ＨｉＳｅｑ？逡逑２０００，對２６個ＨＲＤｓ家系的３１例患者及４例正常成員的全基因組ＤＮＡ樣本進逡逑行目標區(qū)域捕獲測序。數(shù)據(jù)經(jīng)分析濾過，候選突變進行Ｓａｎｇｅｒ直接測序驗證和逡逑致病性評估。逡逑

、中國人群遺傳性視網(wǎng)膜疾病基因診斷平臺的建立逡逑Ｄ．邋１８９－目標捕獲芯片結(jié)合ｎｉｕｍｉｎａ邋Ｈ設(shè)ｅｑ？邋２０００高通量測序逡逑３５例樣本目標區(qū)域捕獲測序由北京華大基因完成［３９１，實驗步驟如下（圖３）；逡逑ＮＧＳ測序逡逑全基因組ＤＮＡ邐前己Ｇ逡逑嗎怳二騎ＸＧＣ仍Ｔ巧ＧＧ的應(yīng)逡逑ｒｘ邐．，萌ＳＣＣＫＧＴＡＣＡＡＣ邋了岳k緯煎義希族沃柿考觳忮偉隋義希模危鈴迤位巍蟈義希停停蓿蓿牛錚睿鈴危В村澹潁潁翦蝸咝岳┰鰣義希齲蓿簦蓿牛錚睿渝畏縸岧逡逑}保輳牛錚鑠澹緬危掊澹懾錼>逡逑ｏ邐＇Ｉub逡逑連接特異性接頭邐八逡逑＾邐與目標芯片雜交邐富集目標ＤＮＡ逡逑Ｖ寒．＼灥；．．淡邋Ｉ媭f巍鰣義希場頌砑渝危掊澹危苠澹鶴ǎ還椋擼擼簦В⒍義希ⅲ粒⒓罨澹蟈澹掊危鄭㈠澹у尉溴義希掊我誨澹輳海肯賜馴塵板義蠆隋澹模危鈴義賢跡常危椋恚猓歟澹牽澹钚蛄脅痘裥酒岷希桑歟歟酰恚椋睿崧劍櫻澹�？２０００高通量矎T虻氖笛榱鞒淌疽饌肌ｅ義希ㄍ計淖藻澹瑁簦簦穡海鰨鰨鰨睿椋恚猓歟澹紓澹睿悖錚恚╁義希ǎ保

本文編號：2561580