【摘要】：研究目的： 1.探討恒溫?zé)茥l件下制作兔角膜重度熱燒傷(severe corneal thermal burn, SCTB)模型的最佳參數(shù)。 2.探討角膜熱燒傷后不同時(shí)間基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)和基質(zhì)金屬蛋白酶-9(natrix metalloproteinase-9, MMP-9)在角膜上清液和房水的濃度變化與角膜損傷程度的關(guān)系。 3.探討兔SCTB早期接受穿透性角膜移植術(shù)(penetrating keratoplasty, PKP)的最佳時(shí)機(jī),探討手術(shù)效果與角膜組織上清液MMP-2和MMP-9濃度的關(guān)系。 4.探討模擬角膜遠(yuǎn)程投送(long distance transportation, LDT)技術(shù)在兔SCTB行PKP治療中應(yīng)用的安全性和實(shí)用性。 研究方法： 1.成年健康新西蘭大白兔36只,雌雄不限,體重2.0-2.5kg。隨機(jī)分為A、B、C、D4組,每組9只(18眼),各組分別設(shè)定不同的制模燒灼溫度100℃、200℃、300℃、400℃。每組在制模時(shí)設(shè)定3個(gè)不同的的燒灼時(shí)間4s、7s、10s。各組內(nèi)每個(gè)燒灼時(shí)間對3只新西蘭大白兔(6眼)進(jìn)行制模。觀察各組制模后角膜的燒傷程度、角膜燙傷區(qū)形態(tài),以及在制模后觀察期內(nèi)角膜組織發(fā)生溶解或穿孔的眼數(shù),根據(jù)角膜燒傷程度進(jìn)行量化評分,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析燒灼溫度、燒灼時(shí)間與角膜燒灼程度的關(guān)系,根據(jù)兔SCTB的判定標(biāo)準(zhǔn)(燒傷程度達(dá)到Ⅲ-Ⅳ度),確定兔SCTB模型制作的最適合燒灼溫度和燒灼時(shí)間。燙傷后3d將實(shí)驗(yàn)動物處死,對制模后不同燒傷程度的角膜行免疫組化HE染色,觀察本實(shí)驗(yàn)條件下制作的兔角膜熱燒傷模型是否符合標(biāo)準(zhǔn)角膜熱燒傷分級的角膜損傷程度。 2.健康的成年新西蘭大白兔21只,雌雄不限,體重2.0-2.5kg,隨機(jī)分為7組：A組：正常對照組；B組：2h組；C組：6h組；D組：12h組；E組：24h組；F組：48h組；G組：72h組。每組3只(6眼),除正常對照組,其余6組新西蘭大白兔雙眼制作SCTB模型。分別在成功制模后2h、6h、12h、24h、48h、和72h按分組處死實(shí)驗(yàn)動物,自角膜緣穿刺抽取雙眼房水0.3mL,自角膜緣切口取雙眼角膜,角膜沿垂直中軸線分為2等份,1份角膜組織勻漿后離心,取上清液,酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)檢測各組角膜組織上清液和房水中MMP-2和MMP-9的濃度。另一份免疫組化染色法(immunohistochemistry, IHC)檢測MMP-2和MMP-9在熱燒傷后角膜組織中的表達(dá)。 3.健康的成年新西蘭大白兔48只,按熱燒傷后接受PKP治療的時(shí)間不同,隨機(jī)分為4組,每組12只,所有實(shí)驗(yàn)動物左眼制作SCTB模型。A組：燒傷后12h行PKP治療；B組：燒傷后24h行PKP治療；C組：燒傷后48h行PKP治療；D組：燒傷后72h行PKP治療。48只新鮮供體角膜均取自健康的成年新西蘭大白兔。觀察術(shù)后角膜植片成活情況、角膜植片透明程度、角膜植片新生血管生長情況。每組分別在PKP術(shù)后20d、40d各隨機(jī)選擇6只實(shí)驗(yàn)動物處死,取術(shù)眼角膜和房水,角膜按垂直中軸線分為2等份,ELISA檢測角膜組織上清液和房水中MMP-2和MMP-9的濃度,IHC檢測角膜植片部位MMP-2和MMP-9的表達(dá)。 4.取自健康成年新西蘭大白兔的供體角膜30只,隨機(jī)分為A、B、C、D、E組5組,每組6只,A組：正常對照組；B、C組：供體角膜單純濕房法保存24h；D、E組：供體角膜濕房保存并進(jìn)行角膜LDT模擬24h。A、B、D組供體角膜用環(huán)鉆鉆取中央部角膜,自垂直中線分成2份,ELISA檢測鉆取部分角膜組織上清液MMP-2和MMP-9的濃度,IHC檢測鉆取部分角膜組織中MMP-2和MMP-9的表達(dá)。環(huán)鉆鉆取后剩余角膜內(nèi)皮臺盼藍(lán)-茜素紅染色,角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度計(jì)數(shù)。觀察濕房法保存及模擬角膜LDT后角膜內(nèi)皮密度及MMP-2和MMP-9在角膜組織上清液的濃度以及在角膜組織內(nèi)的表達(dá)。健康成年新西蘭大白兔12只,隨機(jī)分為F、G兩組,每組6只,左眼制作SCTB模型并在角膜燒傷后24h行PKP治療。F組：供體角膜為C組角膜,G組：供體角膜為E組角膜。術(shù)后40d觀察兩組實(shí)驗(yàn)動物術(shù)眼角膜植片透明程度,測量角膜植片新生血管面積。術(shù)后40d處死實(shí)驗(yàn)動物,取角膜植片沿垂直正中線分為2份,ELISA檢測角膜組織上清液MMP-2和MMP-9的濃度,IHC檢測角膜植片部位MMP-2和MMP-9的表達(dá)。 研究結(jié)果： 1.不同的燒灼溫度和燒灼時(shí)間,造成角膜熱燒傷的程度不同。當(dāng)燒灼溫度≥300℃,燒灼時(shí)間≥7s時(shí),可達(dá)到重度熱燒傷的制模條件。燒灼溫度達(dá)到400℃,易造成角膜組織焦化,燒灼時(shí)間超過7s時(shí)易造成角膜燒傷區(qū)邊界不清。燒灼溫度300℃,燒灼時(shí)間7s時(shí)制模較理想。IHC結(jié)果顯示本實(shí)驗(yàn)條件下制作的兔角膜熱燒傷模型符合標(biāo)準(zhǔn)角膜熱燒傷分級的角膜損傷程度：角膜輕度熱燒傷僅角膜上皮層受損,中度熱燒傷角膜上皮層和淺基質(zhì)層受損,重度熱燒傷全層角膜組織受損。 2.與正常組相比較,角膜組織上清液中MMP-2和MMP-9的濃度在SCTB制模后12h明顯增高,在燒傷后24h達(dá)到高峰,并一直持續(xù)高濃度狀態(tài)至燒傷后72h(P0.01)。燒傷后2h和6h與正常角膜比較無顯著性差異(P0.05),燒傷后12h與24h比較有顯著差異(P0.05),而燒傷后24h、48h、和72h比較無顯著性差異(P0.05)。房水中MMP-2和MMP-9的濃度在角膜熱燒傷后24h明顯增高,并一直持續(xù)高濃度狀態(tài)至燒傷后72h(P0.01)。燒傷后2h、6h、12h比較無顯著性差異(P0.05),12h與24h比較有顯著差異(P0.01),24h、48h和72h比較無顯著性差異(P0.05)。IHC檢測顯示在角膜熱燒傷后2h時(shí),MMP-2在角膜基質(zhì)全層出現(xiàn)表達(dá),并且隨著受傷時(shí)間的延長,表達(dá)強(qiáng)度逐漸增加,24h及以后出現(xiàn)強(qiáng)陽性表達(dá)。MMP-9在角膜燒傷2h時(shí)基底細(xì)胞層出現(xiàn)表達(dá),并逐漸向基質(zhì)層擴(kuò)展,6h時(shí)淺層基質(zhì)出現(xiàn)表達(dá),24h后全基質(zhì)層出現(xiàn)強(qiáng)陽性表達(dá)。 3.兔SCTB經(jīng)PKP治療,術(shù)后所有角膜植片均成活,SCTB制模后接受PKP手術(shù)治療時(shí)間不同,術(shù)后20d和40d角膜植片透明程度有明顯差異(P0.01)。A、B組的角膜植片新生血管面積明顯小于C、D組(P0.01)。術(shù)后20d和40d角膜組織上清液MMP-2和MMP-9的濃度A、B組明顯小于C、D組(P0.01),各組房水中MMP-2和MMP-9的濃度無顯著性差異(P0.05)。IHC檢測結(jié)果顯示：A、B組角膜植片基質(zhì)層纖維排列相對整齊、致密,C、D組角膜植片基質(zhì)層纖維排列不整齊,結(jié)構(gòu)紊亂。所有各組角膜組織切片中MMP-2和MMP-9在各層角膜組織中均見陽性表達(dá),C、D組呈強(qiáng)陽性表達(dá)。 4.經(jīng)濕房保存以及角膜LDT模擬24h后,B、D組角膜與A組角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度計(jì)數(shù)無顯著性差異(P0.05),角膜組織上清液MMP-2和MMP-9的濃度無顯著性差異(P0.05),IHC檢測MMP-2和MMP-9未見明顯表達(dá)。F、G組實(shí)驗(yàn)動物SCTB制模24h接受PKP治療后所有植片成活,術(shù)后40d時(shí)兩組角膜植片新生血管以及透明程度均無顯著性差異(P0.05),角膜組織上清液中MMP-2和MMP-9的濃度無顯著性差異(P0.05)。IHC檢測MMP-2和MMP-9在角膜植片全層呈陽性表達(dá)。 結(jié)論： 1.恒溫條件下建立兔角膜熱燒傷模型,其燒灼溫度越高,燒灼時(shí)間越長,角膜燒傷程度越重。確定兔SCTB模型制作最佳參數(shù)為：燒灼溫度300℃,燒灼時(shí)間7s。恒溫?zé)茥l件制作兔SCTB模型效果良好,能夠達(dá)到全層角膜組織損傷的標(biāo)準(zhǔn)。 2.MMP-2和MMP-9在兔SCTB制模后24h表達(dá)同時(shí)達(dá)到高峰,此時(shí)角膜組織的損害明顯加重,MMP-2和MMP-9均參與了兔SCTB角膜損傷過程,與熱燒傷后角膜組織的損傷溶解關(guān)系密切。 3.兔SCTB制模后24h內(nèi)接受穿透性角膜移植術(shù)治療,能夠取得較好的治療效果。術(shù)后角膜組織上清液MMP-2和MMP-9的濃度與手術(shù)治療效果關(guān)系密切。MMP-2和MMP-9可能參與了術(shù)后角膜植片的修復(fù)過程,其高表達(dá)可能加重了術(shù)后角膜植片的損傷作用。 4.采用濕房法保存角膜經(jīng)LDT提供的供體角膜質(zhì)量可靠,對兔SCTB后接受PKP治療的手術(shù)效果無明顯影響。LDT在兔SCTB早期角膜移植手術(shù)中的應(yīng)用安全、可靠,由此推斷,LDT技術(shù)能夠?yàn)镾CTB的PKP手術(shù)急救治療提供供體角膜,在臨床治療中有良好的應(yīng)用價(jià)值。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R779.65

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本文編號：2546903