本文關(guān)鍵詞：肽聚糖對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎輔助性T細(xì)胞17的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究目的 葡萄膜炎是一大類累及葡萄膜、視網(wǎng)膜、視網(wǎng)膜血管、視乳頭及玻璃體的眼病,常導(dǎo)致眼組織的嚴(yán)重破壞以致視功能的顯著下降或喪失。人類葡萄膜炎是一類種類繁多、病因復(fù)雜的疾病。雖然感染、外傷等多種因素均可引起葡萄膜炎,但多數(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為,自身免疫紊亂所致的葡萄膜炎為最常見(jiàn)和最重要的類型,其中輔助性T細(xì)胞17在自身免疫性葡萄膜炎的發(fā)病機(jī)制中起到重要作用。有研究發(fā)現(xiàn),TLRs與葡萄膜炎的的發(fā)生有關(guān),并且只有TLR2基因與白塞氏病的易感性關(guān)系密切。在近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),Toll樣受體2在自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制中起到關(guān)鍵的致病作用。本研究旨在探討肽聚糖作為Toll樣受體2的配體對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞分泌促炎性因子的影響,分析To11樣受體2對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎中輔助性T細(xì)胞17調(diào)控的機(jī)制,從而進(jìn)一步闡明白身免疫性葡萄膜炎的發(fā)病機(jī)制。 方法 1、樹(shù)突狀細(xì)胞的培養(yǎng),鑒定C57BL/6小鼠骨髓樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic cells, DCs)。 2、在小鼠骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞分化的第6天將DCs分為對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組,實(shí)驗(yàn)組加入PGN刺激,對(duì)照組加入等量無(wú)菌磷酸緩沖鹽溶液,培養(yǎng)24h后利用實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù),檢測(cè)2組培養(yǎng)細(xì)胞中Th17細(xì)胞分化相關(guān)的細(xì)胞因子IL-23、腫瘤壞死因子(TNF)-α (TNF-α)、IL-6、IL-1β mRNA相對(duì)表達(dá)量。 3、建立EAU模型：利用光感受器間維生素A類結(jié)合蛋白(Interphotoreceptor retinoid-binding protein, IRBP)1-20多肽片段與含有結(jié)合分枝桿菌H37RA的弗氏完全佐劑(Complete Freund's adjuvant, CFA)等體積混合并充分乳化,單側(cè)后肢足墊和軀干部皮下注射,免疫C57BL/6小鼠。 4、分離IRBP1-20特異性T細(xì)胞并分別與兩組樹(shù)突狀細(xì)胞共培養(yǎng)：免疫13天分離EAU模型鼠脾臟和淋巴結(jié)的IRBPl-20特異的T細(xì)胞與經(jīng)PGN處理或未處理的樹(shù)突狀細(xì)胞共培養(yǎng),收集共培養(yǎng)后2d的IRBP1-20特異的T細(xì)胞,實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)兩組維甲酸受體相關(guān)孤兒受體(ROR) γt (RORγt)、IL-17、T-bet、γ干擾素(IFN-γ)mRNA相對(duì)表達(dá)量； 5、收集共培養(yǎng)后2、5、7d的細(xì)胞分別進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析,觀察Th17、Thl細(xì)胞的變化。 6、將培養(yǎng)至第6天的DCs隨機(jī)分為對(duì)照組,PGN處理組PGN+SB203580組,并分別與IRBP1-20特異性T細(xì)胞共培養(yǎng),‘并于共培養(yǎng)的第7天,收集T細(xì)胞,流式細(xì)胞儀分析Th17和Th1的變化。 7、將培養(yǎng)至第6天的DCs加入PGN刺激后,分別于0min、15min、30min、1hr收集樹(shù)突狀細(xì)胞,western blot檢測(cè)p-p38。 結(jié)果 1、成功誘導(dǎo)純化并鑒定小鼠樹(shù)突狀細(xì)胞。 2、實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組DCs經(jīng)PGN刺激后IL-23、IL-1βIL-6、TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-14.363、-5.627、-3.85、-28.151; P0.05)。 3、實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組RORγt、IL-17mRNA相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組升高(t=-5.601、-19.76；P0.05),而T-bet、IFN-γ mRNA相對(duì)表達(dá)量變化不大。 4、流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組的DCs與T細(xì)胞共培養(yǎng)后2d、5d、7d, IL-17+細(xì)胞的百分比升高(t=-2.944、-3.03、-4.81; P0.05)而IFN γ+細(xì)胞的比例變化不大(t=-I.25,-0.18,-2.16;P0.05) 5、流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示,SB203580預(yù)處理組與單純PGN處理組相比,IL-17+細(xì)胞的百分比降低。封閉p38MAPK通路抑制了PGN對(duì)Th17細(xì)胞的促進(jìn)作用。 6、western blot結(jié)果顯示經(jīng)PGN刺激后DCs表達(dá)p-p38增多。 結(jié)論 在體外,PGN能夠刺激DCs分泌IL-23、IL-1β、IL-6、TNF-α等與Th17細(xì)胞分化相關(guān)的細(xì)胞因子,促進(jìn)EAU中Th17細(xì)胞的分化和增生。樹(shù)突狀細(xì)胞p38通路與PGN對(duì)Th17細(xì)胞的促進(jìn)作用密切相關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎 Toll樣受體2 抗原特異性T細(xì)胞 Thl7細(xì)胞 樹(shù)突狀細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R773.9
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• ~.略語(yǔ)/符號(hào)說(shuō)明11-12
• 前言12-18
• 研究現(xiàn)狀、成果12-15
• 研究目的、方法15-18
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料18-20
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物18
• 1.1.2 實(shí)驗(yàn)所用的主要儀器和設(shè)備18-19
• 1.1.3 主要試劑及溶液配制19-20
• 1.2 方法20-32
• 1.2.1 樹(shù)突狀細(xì)胞的培養(yǎng),鑒定C57BL/6小鼠骨髓樹(shù)突狀細(xì)胞20-21
• 1.2.2 樹(shù)突狀細(xì)胞的鑒定21
• 1.2.3 樹(shù)突狀細(xì)胞總RNA提取21-22
• 1.2.4 樹(shù)突狀細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄22
• 1.2.5 Quantitative real-time PCR(qPCR)實(shí)時(shí)定量PCR22-24
• 1.2.6 建立C57BL/6小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎動(dòng)物模型24
• 1.2.7 在免疫后的第6天,誘導(dǎo)培養(yǎng)樹(shù)突狀細(xì)胞24-25
• 1.2.8 分離IRBP1-20特異性T細(xì)胞25
• 1.2.9 IRBP1-20特異性T細(xì)胞與樹(shù)突狀細(xì)胞共培養(yǎng)25-26
• 1.2.10 實(shí)時(shí)定量RT-qPCR檢測(cè)共培養(yǎng)的T淋巴細(xì)胞基因變化26-27
• 1.2.11 流式細(xì)胞術(shù)分析Th1與Th17細(xì)胞的比例27
• 1.2.12 流式細(xì)胞儀分析p38抑制劑SB203580對(duì)Th17的影響27
• 1.2.13 western blot檢測(cè)P-P3827-32
• 1.2.14 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理32
• 1.3 結(jié)果32-39
• 1.3.1 小鼠骨髓來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定32
• 1.3.2 樹(shù)突狀細(xì)胞分泌細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果32-34
• 1.3.3 實(shí)時(shí)定量RT-qPCR檢測(cè)共培養(yǎng)的T淋巴細(xì)胞基因變化34-35
• 1.3.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)共培養(yǎng)的T淋巴細(xì)胞中Th1與Th17細(xì)胞的比例35-37
• 1.3.5 抑制p38使Th17細(xì)胞下調(diào)37-38
• 1.3.6 western blot檢測(cè)經(jīng)PGN刺激后樹(shù)突狀細(xì)胞中P-P38的表達(dá)情況38-39
• 1.4 討論39-43
• 結(jié)論43-44
• 參考文獻(xiàn)44-49
• 發(fā)表論文和參加科研情況說(shuō)明49-50
• 綜述50-66
• 綜述參考文獻(xiàn)58-66
• 致謝66

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本文編號(hào)：254533