【摘要】：第一部分靶向鼻咽癌survivinshRNA質(zhì)粒表達載體的構(gòu)建鑒定 目的構(gòu)建pSIREN-survivin/shRNA重組質(zhì)粒并測序鑒定,為探索鼻咽癌基因治療的RNA干擾(RNAi)奠定基礎(chǔ)。 材料與方法根據(jù)基因庫survivin cDNA序列(NM_001168)及Reynolds設(shè)計原則,設(shè)計并合成兩端有酶切位點的65個堿基的寡核苷酸鏈,退火成互補雙鏈后用T4DNA酶克隆至線性化的RNAi-Ready pSIREN-DNR-DsRed-Express質(zhì)粒中；轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5a菌株,提取質(zhì)粒行酶切鑒定,測序分析。 結(jié)果PCR擴增片斷與預(yù)期結(jié)果相符；雙酶切證實重組載體構(gòu)建成功,插入片斷測序結(jié)果與合成的寡核苷酸序列一致。 結(jié)論成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pSIREN-survivin/shRNA,為下一步用脂質(zhì)體包裝并轉(zhuǎn)鼻咽癌組織細胞的研究打下基礎(chǔ)。 第二部分小分子干擾RNA抑制survivin基因表達誘導(dǎo)鼻咽癌CNE-2凋亡的研究 目的觀察應(yīng)用小分子干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)技術(shù)抑制鼻咽癌CNE-2細胞survivin表達對細胞凋亡和增殖的影響。 材料與方法設(shè)計、合成特異性抑制survivin表達的shRNA,轉(zhuǎn)染CNE-2細胞,半定量RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后細胞內(nèi)survivin mRNA變化,流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡率,MTT檢測細胞的增殖。 結(jié)果質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率約為(46.9±1.55)%；轉(zhuǎn)染陽性質(zhì)粒組24h survivinmRNA和蛋白抑制率分別為：(41.58±0.63)%、(68.29±0.52)%；48h抑制率分別增至(63.64±0.96)%、(70.83±0.48)%；陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組24h凋亡率為(36.24±0.78)%,48h增加至(50.37±0.85)%,顯著高于陰性對照組和未處理組,陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組S期細胞減少,G2/M期所占比例增高,出現(xiàn)了G2/M期的阻滯現(xiàn)象；MTT顯示陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細胞的生長減緩。 結(jié)論特異性shRNA可以有效干擾鼻咽癌細胞內(nèi)survivin mRNA和蛋白的表達,誘導(dǎo)細胞的凋亡和抑制細胞的增殖。 第三部分RNAi介導(dǎo)survivin抑制鼻咽癌CNE-2裸鼠移植瘤的實驗研究 目的探討靶向survivin基因的短發(fā)卡RNA (short hairpin RNA, shRNA)對人鼻咽癌CNE2裸鼠移植瘤生長的影響。 材料與方法構(gòu)建裸鼠荷瘤模型,通過瘤內(nèi)多點注射、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染質(zhì)粒,測定腫瘤生長體積、用半定量RT-PCR和免疫組化測定survivin mRNA和蛋白的表達,用透射電鏡檢測survivin shRNA對細胞凋亡的影響并對裸鼠肝腎功進行檢測。 結(jié)果survivin基因序列特異shRNA能有效而穩(wěn)定地抑制鼻咽癌移植瘤survivin mRNA和蛋白的表達；顯著抑制腫瘤組織的生長,促進細胞凋亡,并對裸鼠肝腎功能短期無影響。 結(jié)論RNAi技術(shù)能有效抑制鼻咽癌移植瘤survivin的表達,降低鼻咽癌細胞的增殖能力,促進鼻咽癌細胞凋亡,減緩移植瘤的生長。
【圖文】：

心%戶勺圖1一 2sllRNA產(chǎn)生示意圖2.3將目的基因寡核昔酸鏈連接到質(zhì)粒載體2.3.1目的基因片段的退火1)將己合成的兩條shRNA模板鏈分別稀釋到大約2林g乍L。2)按照下表加入至50林L的退火體系中混勻，將各管置于94℃的水浴鍋中smin，表l一3退火體系寡核普酸體積01190一senseZ林L01190一antisenseZ林L 0.05MHEPES46林L然后讓其緩慢冷卻至室溫，冷卻速度約0.5℃/min，產(chǎn)物置于一20‘C冰箱保存。3)各取l卜L退火產(chǎn)物加99林LHZO做 100倍稀釋備用2.3.2稀釋退火片段分別與線性化質(zhì)粒表達載體的連接其中短目的片斷與線性載體的物質(zhì)的量比為3:1，，22℃反應(yīng)過夜。表1一4連接體系退火后的 ds011901林LPSIREN一DNR一DsRED一ExPressl林L10xbufferl林LT4DNA連接酶l林LddHZO6林L

465bp大小的目的基因條帶，表明質(zhì)粒初步構(gòu)建成功。(其中4、5、7未見條帶，考慮未轉(zhuǎn)化成功)，右側(cè)為陰性組，兩組均出現(xiàn)465bp大小的目的基因條帶。如圖1一3 M:oLZ000DNAm叭 er2000bp、 1000bp、 750bpsoobp、 250bp、 1oobp;一8為pCR產(chǎn)物圖1一3菌落PCR產(chǎn)物2重組質(zhì)粒凝膠電泳1%瓊脂糖凝膠電泳，所示片段分子大小為6.74Okb與設(shè)計的重組質(zhì)粒分子大小一致。如圖1一4 M:SuPercoiledDNALadderMarker11849、10085、8023、6133、5026、3997、3049、ZO87bP;1:陽性質(zhì)粒2:陰性質(zhì)粒圖1一4重組質(zhì)粒凝膠電泳結(jié)果3.重組載體的酶切鑒定將重組質(zhì)粒psIREN一survivi眺hRNA分別進行EcoRI和BamHI單、雙酶切電泳(圖1一5)。因重組質(zhì)粒插入片斷分別含有Eco斑和BamHI酶切位點，可被分別切開成單一線性片斷，也可被同時切開成為大小兩個線性片斷，圖中可見，單酶切的質(zhì)粒長度不變，但比同樣大小的環(huán)狀質(zhì)粒電泳速度慢而在上方;而雙酶切可見下方約65如的目的基因條帶，而空的白質(zhì)粒
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R739.63

【引證文獻】

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1 趙留芳;李曉江;馬靜;王涵;張楠;王虎;;短發(fā)卡RNA抑制survivin表達并誘導(dǎo)CNE-2細胞凋亡[J];西安交通大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2012年04期

本文編號：2544781