【摘要】：研究背景：Waardenburg綜合征(Waardenburg Syndrome,WS)是以聽力障礙和色素分布異常為主要表現(xiàn)的遺傳綜合征,以常染色體顯性遺傳為主,具有高度的遺傳異質性。WS根據(jù)臨床表型不同,可以分為四型：WS1、WS2、WS3、WS4。其中WS2是最常見的一種類型,目前發(fā)現(xiàn)致病基因有MITF、SOX10和SNAI2,MITF和SOX10約各占所有WS2病人致病原因的15%,仍有70%的WS2病人未找到致病因素,且基因突變如何導致表型發(fā)生的分子機制尚不清楚。 目的和方法：為了進一步探討WS2患者的基因型與表型的內在聯(lián)系,本研究通過以下方案探討WS的分子機制：1.收集WS2家系,采集每個患者的詳細臨床資料,并對相關致病基因MITF、SOX10、 SNAI2的外顯子進行突變篩查。2.對發(fā)現(xiàn)的MITF基因R255X突變,構建真核表達質粒pCMV-R255X-Flag,瞬時轉染黑色素瘤細胞,Western Blot驗證突變蛋白表達量,免疫熒光檢測突變蛋白的亞細胞分布情況。3.將Mitf RNAi品系果蠅與GAL4品系果蠅雜交,觀察子一代果蠅的表型。 結果：1.總共收集到3個WS2家系,5個散發(fā)病例。并在其中的兩個大家系中分別發(fā)現(xiàn)MITF基因的c.763CT(R255X)和c.328CT (R110X)雜合突變,剩余病例未找到致病原因。R255X已在1個4代中國家系中報道,而R110X則見于2個中國家系,進一步驗證發(fā)現(xiàn)這兩個突變在各自的家系中是共分離的。2.成功構建pCMV-R255X-Flag突變質粒,瞬時轉染進UACC903黑色素瘤細胞,發(fā)現(xiàn)突變的蛋白表達量明顯減少,證實R255X突變的MITF基因編碼的是一個截短型蛋白；免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn),野生型MITF蛋白主要分布在細胞核中,而R255X突變蛋白除了在細胞核中分布外,也有相當大的一部分在細胞質中分布。3.運用GMR-GAL4、Da-GAL4驅動UAS-Mitf RNAi表達,其F1代的表型與對照組無明顯差異。 結論：1.MITF基因的R255X和R110X是中國人群WS2的突變熱點,約75%的WS2病例未找到致病原因,提示存在未知的致病基因。2.R255X突變蛋白由于喪失了部分HLH、全部Zip及之后的全部區(qū)域,出現(xiàn)蛋白表達下降和異常的亞細胞分布,導致WS2的發(fā)生。完整的蛋白質和正確的亞細胞分布,對于MITF功能的行使具有重要意義。3.果蠅Mitf的表達具有時空上的特異性,需要更特異性的GAL4才能驅動其表達。
[Abstract]:Background: Waardenburg syndrome (Waardenburg Syndrome,WS) is a genetic syndrome characterized by hearing impairment and abnormal pigment distribution. WS can be divided into four types according to its clinical phenotype: WS1,WS2,WS3,WS4. WS is characterized by autosomal dominant inheritance and high genetic heterogeneity. WS can be divided into four types according to clinical phenotype. Among them, WS2 is the most common type. At present, it is found that MITF,SOX10 and SNAI2,MITF and SOX10 account for about 15% of all WS2 patients, and 70% of WS2 patients still do not find pathogenic factors, and the molecular mechanism of gene mutation leading to phenotype is not clear. Objective and methods: in order to further explore the internal relationship between genotype and phenotype in patients with WS2, the molecular mechanism of WS was discussed by the following schemes: 1. The WS2 family was collected, the detailed clinical data of each patient were collected, and the mutations in the exons of the related pathogenic gene MITF,SOX10, SNAI2 were screened. 2. For the R255X mutation of MITF gene, the eukaryotic expression plasmid pCMV-R255X-Flag, was constructed and the expression of mutant protein was verified by, Western Blot, and the subcellular distribution of mutant protein was detected by immunofluorescence. The phenotype of the first generation of Drosophila melanogaster was observed by crossing Mitf RNAi strain with GAL4 strain. Results: 1. A total of 3 WS2 families and 5 sporadic cases were collected. The c.763CT (R255X) and c.328CT (R110X) heterozygous mutations of MITF gene were found in two lines, and no cause was found in the remaining cases. R255X has been reported in a Chinese family of 4 generations, while R110X is found in two Chinese families. It is further confirmed that the two mutations are co-separated in their families. 2. The pCMV-R255X-Flag mutant plasmid was successfully constructed and transiently transferred into UACC903 melanoma cells. It was found that the expression of the mutant protein was significantly decreased, which confirmed that the MITF gene of R255X mutation encoded a truncated protein. Immunofluorescence assay showed that the wild type MITF protein was mainly distributed in the nucleus, while the R255X mutant protein was also distributed in the cytoplasm. Using GMR-GAL4,Da-GAL4 to drive the expression of UAS-Mitf RNAi, the phenotype of F1 generation was not significantly different from that of the control group. Conclusion: R255X and R110X of 1.MITF gene are the hot spots of WS2 mutation in Chinese population. About 75% of WS2 cases have no unknown pathogenic gene. 2.R255X mutant protein lost all Zip of HLH, and all regions after WS2, resulting in decreased protein expression and abnormal subcellular distribution, which led to the occurrence of R255X. Complete protein and correct subcellular distribution are of great significance for the exercise of MITF function. 3. The expression of Mitf in Drosophila melanogaster is space-time specific and requires more specific GAL4 to drive its expression.
【學位授予單位】：中南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R764;R3416

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