發(fā)布時間：2019-05-31 08:29

【摘要】：研究背景和目的： 視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelial，RPE）細(xì)胞的變性、壞死和丟失可造成視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜的損害，導(dǎo)致視網(wǎng)膜變性類疾病的發(fā)生和視力下降。目前尚無有效治療RPE變性的方法。細(xì)胞移植是治療RPE細(xì)胞變性的具有前景的方法，但是如何獲得數(shù)量充足的、低免疫排斥和低成瘤風(fēng)險的RPE細(xì)胞是目前細(xì)胞治療RPE變性的所面臨的主要問題。而在可用于視網(wǎng)膜變性疾病治療的干細(xì)胞中，胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESCs）因其全能分化特性（可分化為包括RPE在內(nèi)的體內(nèi)所有細(xì)胞類型）和無限增殖能力，被認(rèn)為是可用于視網(wǎng)膜變性類疾病治療的重要種子細(xì)胞。然而，ESCs來源的治療細(xì)胞的免疫排斥和成瘤風(fēng)險、以及不可控增殖、倫醫(yī)學(xué)等問題限制了ESCs的臨床轉(zhuǎn)化。和ESCs相比，目前已在臨床廣泛應(yīng)用的自體成體干細(xì)胞可避免免疫排斥和成瘤風(fēng)險，且自體取材可規(guī)避倫理障礙。在本課題中，，我們重點研究是否能將成體干細(xì)胞中的間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）誘導(dǎo)分化為RPE樣的細(xì)胞，并且具備天然RPE細(xì)胞的生理功能，并最終轉(zhuǎn)化成為治療視網(wǎng)膜變性類疾病的理想種子細(xì)胞。 方法： 1、hMSCs和豬RPE細(xì)胞的分離 （1）原代分離和純化獲得hMSCs和豬RPE細(xì)胞，觀察細(xì)胞形態(tài)； （2）hMSCs和豬RPE細(xì)胞標(biāo)記檢測、hMSCs成骨誘導(dǎo)分化鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色、成軟骨誘導(dǎo)分化甲苯胺藍(lán)染色和成脂肪誘導(dǎo)分化油紅-0染色鑒定hMSCs；免疫熒光鑒定豬RPE細(xì)胞。 2、hMSCs和豬RPE的共培養(yǎng)及其向RPE細(xì)胞的分化 （1）Transwell共培養(yǎng)法誘導(dǎo)hMSCs向RPE細(xì)胞分化；條件培養(yǎng)基法誘導(dǎo)hMSCs向RPE細(xì)胞分化； （2）hMSCs來源RPE細(xì)胞的鑒定 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞內(nèi)色素含量的定量分析、透射電鏡檢測、Real-time PCR、免疫熒光染色檢測、吞噬實驗和細(xì)胞斷層掃描、Western Blot、驗證MERTK蛋白在誘導(dǎo)細(xì)胞特異性吞噬功能中的作用和誘導(dǎo)細(xì)胞的神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌能力檢測。 3、hMSCs來源RPE細(xì)胞對急、慢性視網(wǎng)膜變性的修復(fù)作用 （1）碘酸鈉注射制備急性視網(wǎng)膜變性大鼠模型及鑒定：HE染色和F-ERG檢測； （2）急性視網(wǎng)膜變性大鼠模型視網(wǎng)膜下腔移植分別于移植后4周、8周檢測以下指標(biāo)：細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、免疫熒光染色檢測hESCs來源的RPE細(xì)胞、吞噬實驗和細(xì)胞斷層掃描、移植后免疫熒光染色檢測、F-ERG和Western Blot。 （3）選取21天齡的RCS白化大鼠進(jìn)行視網(wǎng)膜下腔移植，分別于移植后4周、8周檢測以下指標(biāo)：外核層厚度的測量、移植后細(xì)胞的免疫熒光染色檢測、F-ERG和Western Blot檢測細(xì)胞在體的吞噬能力。 結(jié)果： 1、hMSCs的鑒定 （1）hMSCs形態(tài)多為梭形成纖維細(xì)胞樣外觀，呈旋渦狀排列；豬RPE細(xì)胞外形呈多邊形，細(xì)胞內(nèi)充滿了棕黑色的色素顆粒； （2）hMSCs的表面標(biāo)志CD73、CD90、CD105表達(dá)強陽性，而CD14、CD45、CD34陰性；茜素紅染色后，細(xì)胞間出現(xiàn)致密的、圓形不透光團(tuán)塊狀的紅色結(jié)節(jié)；阿新藍(lán)染色可見細(xì)胞外基質(zhì)被染成藍(lán)色，成條索狀錯綜排列；油紅-0染色細(xì)胞中含有被染成紅色的脂肪顆粒；豬RPE細(xì)胞CRALBP、RPE65、ZO-1表達(dá)均為陽性。 2、hMSCs向RPE細(xì)胞的分化 （1）hMSCs共培養(yǎng)誘導(dǎo)后的RPE樣細(xì)胞可觀察到hMSCs中出現(xiàn)豐富的色素顆粒，含量接近于成體豬的RPE細(xì)胞，而采用條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)法獲得細(xì)胞色素含量較少； （2）共培養(yǎng)hMSCs-RPE細(xì)胞的色素含量與RPE細(xì)胞相比無統(tǒng)計學(xué)差異，條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)hMSCs-RPE細(xì)胞內(nèi)色素顆粒含量與共培養(yǎng)hMSCs-RPE細(xì)胞的色素含量相比具有統(tǒng)計學(xué)差異； （3）透射電鏡觀察見hMSCs-RPE細(xì)胞內(nèi)可見成熟的色素顆粒，細(xì)胞頂端可見典型的微絨毛結(jié)構(gòu)； （4）hMSCs-RPE細(xì)胞表達(dá)RPE細(xì)胞特異的基因MITF、OTX2、tyrosinase、RPE65、Bestrophine、PEDF、PMEL17、CRALBP、PAX6和誘導(dǎo)前相比都顯著上調(diào)，且和原代分離的人RPE細(xì)胞的表達(dá)水平相類似； （5）hMSCs-RPE細(xì)胞可表達(dá)RPE細(xì)胞特異的蛋白CRALBP、RPE65和ZO-1； （6）FITC標(biāo)記的POS和hMSCs-RPE細(xì)胞共孵育后，豬RPE細(xì)胞和誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)均可觀察到綠色熒光，而未誘導(dǎo)的hMSCs內(nèi)未見到綠色熒光；hMSCs-RPE細(xì)胞MERTK蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，αvβ5Integrin的表達(dá)也有所上調(diào)， MERTK抗體封閉掉該受體的功能后，吞噬POS的能力顯著下降； （7）hMSCs-RPE細(xì)胞BDNF和GDNF的分泌量上調(diào)明顯，但仍顯著低于豬RPE細(xì)胞。 3、hMSCs來源RPE細(xì)胞對急、慢性視網(wǎng)膜變性的修復(fù)作用 （1）碘酸鈉損傷模型的視網(wǎng)膜HE染色可見后極部RPE細(xì)胞幾乎完全損毀，部分RPE細(xì)胞死亡后殘留的色素團(tuán)塊殘留于Bruch’s膜上，上方的感光細(xì)胞層呈波浪形；F-ERG顯示A波和B波的幅值較正常大鼠均顯著降低； (2）碘酸鈉損傷的急性視網(wǎng)膜變性模型中，移植后4周、8周視網(wǎng)膜免疫熒光染色共聚焦掃描可見，hMSC來源的RPE細(xì)胞可表達(dá)mitochondrial和CRALBP； （3）碘酸鈉損傷的急性視網(wǎng)膜變性模型中，移植后4周、8周F-ERG結(jié)果顯示了hMSCs-RPE細(xì)胞移植后較偽手術(shù)組和移植未誘導(dǎo)分化的hMSC組，A波和B波的波幅明顯升高，具有統(tǒng)計學(xué)意義； （4）碘酸鈉損傷的急性視網(wǎng)膜變性模型中，移植后4周和8周視網(wǎng)膜總蛋白的Western Blot結(jié)果顯示rhodopsin的表達(dá)量在移植hMSCs-RPE細(xì)胞組較偽手術(shù)組和移植hMSC組明顯升高，具有統(tǒng)計學(xué)意義。 （5）RCS慢性視網(wǎng)膜變性模型中，移植后4周和8周hMSCs-RPE細(xì)胞組較偽手術(shù)組和移植hMSC組大鼠視網(wǎng)膜外核層厚度明顯增厚，具有統(tǒng)計學(xué)意義； （6）RCS慢性視網(wǎng)膜變性模型中，移植后4周和8周視網(wǎng)膜免疫熒光染色共聚焦掃描可見，hMSC來源的RPE細(xì)胞可表達(dá)mitochondrial和CRALBP，但在8周時間點移植細(xì)胞存活較4周明顯減少； （7）RCS慢性視網(wǎng)膜變性模型中，移植后4周F-ERG結(jié)果顯示hMSCs-RPE細(xì)胞組較偽手術(shù)組和移植hMSC組，A波和B波的波幅明顯升高，，具有統(tǒng)計學(xué)意義；而在移植后8周，各組電生理均呈熄滅型，各組間幅值無統(tǒng)計學(xué)差異； （8）RCS慢性視網(wǎng)膜變性模型中，移植后4周、8周視網(wǎng)膜總蛋白的Western Blot結(jié)果顯示，MERTK蛋白的表達(dá)在移植hMSC來源的RPE細(xì)胞組4周為陽性8周時呈陰性，偽手術(shù)4周、8周均為陰性； （9）RCS慢性視網(wǎng)膜變性模型中，移植后4周和8周視網(wǎng)膜免疫熒光染色共聚焦掃描可見，4周時RPE65陽性的移植細(xì)胞內(nèi)存在rhodopsin陽性的感光細(xì)胞外節(jié)，而8周時未見RPE65陽性的移植細(xì)胞內(nèi)存在rhodopsin陽性的感光細(xì)胞外節(jié)。 結(jié)論： 1、成功分離獲得了hMSCs和豬RPE細(xì)胞，獲得細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞表面標(biāo)志符合hMSCs和豬RPE細(xì)胞的特性； 2、通過Transwell構(gòu)建hMSCs和RPE細(xì)胞的體外非接觸共培養(yǎng)體系，誘導(dǎo)hMSCs向RPE細(xì)胞分化，誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞的體外生物學(xué)特性和功能類似于原代分離的RPE細(xì)胞。 3、碘酸鈉尾靜脈注射制造的急性視網(wǎng)膜變性大鼠模型，其視網(wǎng)膜組織和結(jié)構(gòu)改變符合急性視網(wǎng)膜變性的改變； 4、碘酸鈉損傷的急性視網(wǎng)膜變性大鼠經(jīng)移植hMSCs-RPE細(xì)胞后，對感光細(xì)胞具有更好的保護(hù)作用、對視功能有更好的維持作用； 5、在RCS大鼠慢性視網(wǎng)膜變性模型中，移植hMSCs-RPE細(xì)胞后，具有吞噬感光細(xì)胞外節(jié)的能力；但在移植后8周存活細(xì)胞數(shù)量顯著降低，少量細(xì)胞表達(dá)成熟RPE細(xì)胞的標(biāo)記，未觀察到移植細(xì)胞具有吞噬感光細(xì)胞外節(jié)的能力，對視功能的維持作用消失。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R774.13

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 劉厚奇,馮根生;人干細(xì)胞的分化研究及臨床應(yīng)用探索[J];第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2003年09期

本文編號：2489544