【摘要】：耳聾是全球性重大公共衛(wèi)生問題,由毛細胞功能障礙引起的感音神經(jīng)性耳聾是最常見的一種。內(nèi)耳毛細胞是一種終末分化細胞,可以作為一種感受器將聲音刺激轉(zhuǎn)化為電信號而傳入大腦。毛細胞很容易受到噪音、年齡和氨基糖苷類耳毒性藥物的影響而被損壞。哺乳動物中毛細胞的丟失是不可再生的,從而導致永久性的聽力損傷。近十年來,干細胞治療技術(shù)興起為眾多人類重大疾病的治療帶來了新的革命。干細胞具有全能或多能性以及高度的自我增殖能力,其干性維持及分化是組織發(fā)育和再生修復的驅(qū)動力。利用干細胞相關技術(shù),將使聽覺系統(tǒng)損傷修復特別是受損毛細胞的再生和修復成為可能,有望從根本上治療耳聾這一頑疾。 內(nèi)耳干細胞是內(nèi)耳毛細胞重生的重要種子細胞,可能存在于內(nèi)耳前庭橢圓囊和球囊、耳蝸基底膜以及半規(guī)管壺腹脊等區(qū)域。研究證明內(nèi)耳干細胞可以自我更新并具有多分化潛能,在合適的誘導條件下可以分化為毛細胞。但是在內(nèi)耳干細胞及毛細胞的相關研究中依舊存在很多問題。主要包括：1、內(nèi)耳干細胞數(shù)目十分有限,其在內(nèi)耳中的具體分布還不是特別清楚,體外培養(yǎng)條件復雜、培養(yǎng)難度大。2、內(nèi)耳干細胞體外誘導分化為毛細胞的分子機制還還不甚明了,分化產(chǎn)生的毛細胞不具有典型的毛細胞特性,沒有功能。3、缺乏特異性分子標志對內(nèi)耳干細胞、祖細胞和毛細胞進行鑒定和分選。因此,本研究的前兩部分內(nèi)容(即第二章和第三章)主要研究內(nèi)耳干細胞的體外分離、培養(yǎng)、鑒定以及如何在體外將內(nèi)耳干細胞誘導分化為具有典型靜纖毛和電生理反應的成熟毛細胞。最后一個部分,主要研究了內(nèi)耳干細胞分化為毛細胞這一過程中基因的表達情況,并篩選出了干細胞、祖細胞和毛細胞的特異性分子標志。 第一部分：主要研究了新生PO天ICR小鼠耳蝸基底膜上內(nèi)耳干細胞的分離及培養(yǎng)方法,并將培養(yǎng)得到的內(nèi)耳干細胞進行了一系列的干細胞、祖細胞及發(fā)育相關標志基因的檢測。實驗結(jié)果表明耳蝸基底膜上的細胞形成的細胞球表達內(nèi)耳干細胞和祖細胞的標志基因,說明培養(yǎng)得到的確實為內(nèi)耳干細胞,但是有部分細胞已經(jīng)發(fā)育到祖細胞階段。Brdu檢測顯示細胞球中的絕大部分細胞為陽性,表明絕大部分細胞為增殖產(chǎn)生。免疫細胞化學檢測同樣顯示細胞球中的細胞表達Nestin蛋白。 第二部分：為了進一步將分離得到的內(nèi)耳干細胞誘導分化為具有功能的毛細胞。我們將內(nèi)耳干細胞接種在經(jīng)多聚賴氨酸處理過的培養(yǎng)板中,貼壁誘導分化。選取內(nèi)耳干細胞、干細胞體外分化7天以及分化14天這三個時間點的細胞進行基因和蛋白檢測。結(jié)果表明內(nèi)耳干細胞標志基因在分化過程中表達下調(diào),內(nèi)耳發(fā)育相關基因在分化過程中保持表達,而內(nèi)耳毛細胞標志基因在分化過程中表達上調(diào)。免疫熒光檢測表明,分化14天之后,部分細胞表達毛細胞特異蛋白MyosinVIIA、Bm3c以及Espin。掃描電鏡檢測顯示,內(nèi)耳干細胞表面沒有靜纖毛,而誘導分化之后部分細胞存在雜亂的靜纖毛。說明部分內(nèi)耳干細胞分化成不成熟的毛細胞。為了在體外誘導得到成熟的毛細胞,我們采用兩步誘導法來將內(nèi)耳干細胞誘導成功能性毛細胞。首先,我們將內(nèi)耳干細胞接種在多聚賴氨酸預處理過的培養(yǎng)皿上,將內(nèi)耳干細胞誘導為內(nèi)耳祖細胞。然后,我們將內(nèi)耳祖細胞接種在滅活的雞胚橢圓囊基質(zhì)細胞上誘導分化。結(jié)果表明生成的毛細胞表面存在成束的規(guī)則排列的靜纖毛,具有F-actin豐富的凸起并且表達動纖毛標志Tubulin。這些毛細胞可以吸收FM-143,并經(jīng)膜片鉗檢測證明具有電生理功能。這提示我們,在理想的培養(yǎng)條件下,內(nèi)耳干細胞在體外可以誘導分化為具有功能的成熟毛細胞。 第三部分：內(nèi)耳毛細胞的發(fā)育過程受到一系列的轉(zhuǎn)錄因子以及信號通路的調(diào)控,鑒定和調(diào)控內(nèi)耳毛細胞發(fā)育過程中的關鍵基因有助于控制毛細胞的分化。我們選取內(nèi)耳干細胞、內(nèi)耳干細胞分化7天形成的祖細胞以及分化14天形成的毛細胞這三個不同發(fā)育階段的細胞為研究對象。毛細胞通過FM1-43特異標志后經(jīng)流式分選得到。提取出這3種細胞的RNA進行Phalanx小鼠基因表達譜芯片的檢測,檢測出不同基因在這三個階段的表達情況。我們在內(nèi)耳干細胞、祖細胞和毛細胞中分別篩選出30、38和31個特異表達的基因,并在小鼠不同組織中進行了特異性檢測。最后確定Gdf10+Ccdc121組合可以作為干細胞特異性標志基因；Tmprss9+Orml組合為祖細胞特異性標志基因；Chrna9+Espnl組合為毛細胞特異性標志基因。本研究的主要目的是發(fā)現(xiàn)新的毛細胞及其前體細胞(包括干細胞與祖細胞)的分子標志,為內(nèi)耳干細胞的準確鑒定及快速無損的分選提供了條件和依據(jù)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R764.431

【共引文獻】

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本文編號：2475471