【摘要】：耳聾是全球性重大公共衛(wèi)生問題,由毛細(xì)胞功能障礙引起的感音神經(jīng)性耳聾是最常見的一種。內(nèi)耳毛細(xì)胞是一種終末分化細(xì)胞,可以作為一種感受器將聲音刺激轉(zhuǎn)化為電信號而傳入大腦。毛細(xì)胞很容易受到噪音、年齡和氨基糖苷類耳毒性藥物的影響而被損壞。哺乳動物中毛細(xì)胞的丟失是不可再生的,從而導(dǎo)致永久性的聽力損傷。近十年來,干細(xì)胞治療技術(shù)興起為眾多人類重大疾病的治療帶來了新的革命。干細(xì)胞具有全能或多能性以及高度的自我增殖能力,其干性維持及分化是組織發(fā)育和再生修復(fù)的驅(qū)動力。利用干細(xì)胞相關(guān)技術(shù),將使聽覺系統(tǒng)損傷修復(fù)特別是受損毛細(xì)胞的再生和修復(fù)成為可能,有望從根本上治療耳聾這一頑疾。 內(nèi)耳干細(xì)胞是內(nèi)耳毛細(xì)胞重生的重要種子細(xì)胞,可能存在于內(nèi)耳前庭橢圓囊和球囊、耳蝸基底膜以及半規(guī)管壺腹脊等區(qū)域。研究證明內(nèi)耳干細(xì)胞可以自我更新并具有多分化潛能,在合適的誘導(dǎo)條件下可以分化為毛細(xì)胞。但是在內(nèi)耳干細(xì)胞及毛細(xì)胞的相關(guān)研究中依舊存在很多問題。主要包括：1、內(nèi)耳干細(xì)胞數(shù)目十分有限,其在內(nèi)耳中的具體分布還不是特別清楚,體外培養(yǎng)條件復(fù)雜、培養(yǎng)難度大。2、內(nèi)耳干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為毛細(xì)胞的分子機制還還不甚明了,分化產(chǎn)生的毛細(xì)胞不具有典型的毛細(xì)胞特性,沒有功能。3、缺乏特異性分子標(biāo)志對內(nèi)耳干細(xì)胞、祖細(xì)胞和毛細(xì)胞進行鑒定和分選。因此,本研究的前兩部分內(nèi)容(即第二章和第三章)主要研究內(nèi)耳干細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)、鑒定以及如何在體外將內(nèi)耳干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為具有典型靜纖毛和電生理反應(yīng)的成熟毛細(xì)胞。最后一個部分,主要研究了內(nèi)耳干細(xì)胞分化為毛細(xì)胞這一過程中基因的表達(dá)情況,并篩選出了干細(xì)胞、祖細(xì)胞和毛細(xì)胞的特異性分子標(biāo)志。 第一部分：主要研究了新生PO天ICR小鼠耳蝸基底膜上內(nèi)耳干細(xì)胞的分離及培養(yǎng)方法,并將培養(yǎng)得到的內(nèi)耳干細(xì)胞進行了一系列的干細(xì)胞、祖細(xì)胞及發(fā)育相關(guān)標(biāo)志基因的檢測。實驗結(jié)果表明耳蝸基底膜上的細(xì)胞形成的細(xì)胞球表達(dá)內(nèi)耳干細(xì)胞和祖細(xì)胞的標(biāo)志基因,說明培養(yǎng)得到的確實為內(nèi)耳干細(xì)胞,但是有部分細(xì)胞已經(jīng)發(fā)育到祖細(xì)胞階段。Brdu檢測顯示細(xì)胞球中的絕大部分細(xì)胞為陽性,表明絕大部分細(xì)胞為增殖產(chǎn)生。免疫細(xì)胞化學(xué)檢測同樣顯示細(xì)胞球中的細(xì)胞表達(dá)Nestin蛋白。 第二部分：為了進一步將分離得到的內(nèi)耳干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為具有功能的毛細(xì)胞。我們將內(nèi)耳干細(xì)胞接種在經(jīng)多聚賴氨酸處理過的培養(yǎng)板中,貼壁誘導(dǎo)分化。選取內(nèi)耳干細(xì)胞、干細(xì)胞體外分化7天以及分化14天這三個時間點的細(xì)胞進行基因和蛋白檢測。結(jié)果表明內(nèi)耳干細(xì)胞標(biāo)志基因在分化過程中表達(dá)下調(diào),內(nèi)耳發(fā)育相關(guān)基因在分化過程中保持表達(dá),而內(nèi)耳毛細(xì)胞標(biāo)志基因在分化過程中表達(dá)上調(diào)。免疫熒光檢測表明,分化14天之后,部分細(xì)胞表達(dá)毛細(xì)胞特異蛋白MyosinVIIA、Bm3c以及Espin。掃描電鏡檢測顯示,內(nèi)耳干細(xì)胞表面沒有靜纖毛,而誘導(dǎo)分化之后部分細(xì)胞存在雜亂的靜纖毛。說明部分內(nèi)耳干細(xì)胞分化成不成熟的毛細(xì)胞。為了在體外誘導(dǎo)得到成熟的毛細(xì)胞,我們采用兩步誘導(dǎo)法來將內(nèi)耳干細(xì)胞誘導(dǎo)成功能性毛細(xì)胞。首先,我們將內(nèi)耳干細(xì)胞接種在多聚賴氨酸預(yù)處理過的培養(yǎng)皿上,將內(nèi)耳干細(xì)胞誘導(dǎo)為內(nèi)耳祖細(xì)胞。然后,我們將內(nèi)耳祖細(xì)胞接種在滅活的雞胚橢圓囊基質(zhì)細(xì)胞上誘導(dǎo)分化。結(jié)果表明生成的毛細(xì)胞表面存在成束的規(guī)則排列的靜纖毛,具有F-actin豐富的凸起并且表達(dá)動纖毛標(biāo)志Tubulin。這些毛細(xì)胞可以吸收FM-143,并經(jīng)膜片鉗檢測證明具有電生理功能。這提示我們,在理想的培養(yǎng)條件下,內(nèi)耳干細(xì)胞在體外可以誘導(dǎo)分化為具有功能的成熟毛細(xì)胞。 第三部分：內(nèi)耳毛細(xì)胞的發(fā)育過程受到一系列的轉(zhuǎn)錄因子以及信號通路的調(diào)控,鑒定和調(diào)控內(nèi)耳毛細(xì)胞發(fā)育過程中的關(guān)鍵基因有助于控制毛細(xì)胞的分化。我們選取內(nèi)耳干細(xì)胞、內(nèi)耳干細(xì)胞分化7天形成的祖細(xì)胞以及分化14天形成的毛細(xì)胞這三個不同發(fā)育階段的細(xì)胞為研究對象。毛細(xì)胞通過FM1-43特異標(biāo)志后經(jīng)流式分選得到。提取出這3種細(xì)胞的RNA進行Phalanx小鼠基因表達(dá)譜芯片的檢測,檢測出不同基因在這三個階段的表達(dá)情況。我們在內(nèi)耳干細(xì)胞、祖細(xì)胞和毛細(xì)胞中分別篩選出30、38和31個特異表達(dá)的基因,并在小鼠不同組織中進行了特異性檢測。最后確定Gdf10+Ccdc121組合可以作為干細(xì)胞特異性標(biāo)志基因；Tmprss9+Orml組合為祖細(xì)胞特異性標(biāo)志基因；Chrna9+Espnl組合為毛細(xì)胞特異性標(biāo)志基因。本研究的主要目的是發(fā)現(xiàn)新的毛細(xì)胞及其前體細(xì)胞(包括干細(xì)胞與祖細(xì)胞)的分子標(biāo)志,為內(nèi)耳干細(xì)胞的準(zhǔn)確鑒定及快速無損的分選提供了條件和依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R764.431

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 郭瑋;徐劍文;;NeuroD對細(xì)胞分化的影響[J];福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2008年02期

2 Nan Su;Min Jin;Lin Chen;;Role of FGF/FGFR signaling in skeletal development and homeostasis: learning from mouse models[J];Bone Research;2014年01期

3 Lauren A.Kilpatrick;Devadoss J Samuvel;Nancy Smythe;;Ouabain-Induced Auditory Nerve Degeneration in Congenic Ly5.1 Mice[J];Journal of Otology;2011年02期

4 薛濤;邱建華;;聽覺系統(tǒng)干細(xì)胞與前體細(xì)胞[J];臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志;2009年10期

5 Wang Junli;Xu Yinglong;Zhao Yuli;Xu Min;;Different morphologic features of rat cochlea progenitor spheres and their implications[J];Journal of Medical Colleges of PLA;2012年06期

6 鄧曉聰;楊新明;;哺乳動物內(nèi)耳毛細(xì)胞的再生和功能恢復(fù)的研究進展[J];南通大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2013年02期

7 彭靜;黃聰;蔣思文;;誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞(iPSCs)的臨床應(yīng)用進展[J];科學(xué)通報;2014年09期

8 沈菊;鄒輝文;向維仁;;內(nèi)鏡下自體耳屏軟骨膜鼓室成形術(shù)的臨床研究[J];實用臨床醫(yī)學(xué);2014年03期

9 王曉花;章建程;王慶敏;李中付;周宏元;袁海霞;;白細(xì)胞介素-1對新生大鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞再生能力的影響[J];海軍醫(yī)學(xué)雜志;2014年05期

10 涂雪松;;干細(xì)胞及其誘導(dǎo)技術(shù)在培育成體細(xì)胞、篩選藥物和移植實驗中的作用[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;2015年02期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 閆曦;間充質(zhì)干細(xì)胞用于實體組織治療的潛在機制分析及在肺照射損傷模型中的應(yīng)用[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2011年

2 黑任軼;microRNA在耳蝸前體細(xì)胞增殖和分化中的作用探討[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2011年

3 王宇澄;大鼠耳蝸氨基糖甙類藥物損傷后出現(xiàn)的新細(xì)胞[D];復(fù)旦大學(xué);2004年

4 侯昭暉;軟骨細(xì)胞特異性Smad4條件基因敲除導(dǎo)致小鼠聽力喪失和內(nèi)耳發(fā)育畸形的相關(guān)研究[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進修學(xué)院;2007年

5 鄧安春;Smad4基因在小鼠內(nèi)耳前庭發(fā)育中作用的初步研究[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進修學(xué)院;2007年

6 高雪;LIM蛋白CRP2及CRIP2在大鼠內(nèi)耳的表達(dá)及在嗅球前體細(xì)胞中的分布[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2008年

7 林穎;體外共培養(yǎng)誘導(dǎo)嗅球神經(jīng)前體細(xì)胞分化為功能性外周神經(jīng)元[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2008年

8 薛濤;新生大鼠腦干耳蝸核存在神經(jīng)前體細(xì)胞的初步證據(jù)[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2008年

9 袁偉;腺病毒介導(dǎo)的A20基因?qū)Χ伱?xì)胞保護作用的實驗研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2008年

10 田永勝;小鼠聽囊細(xì)胞的培養(yǎng)、自然分化、移植與小鼠聽覺剝奪后蝸神經(jīng)核可塑性的研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2008年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 李利;胚胎干細(xì)胞大鼠內(nèi)耳導(dǎo)入后的遷移與分化[D];南京醫(yī)科大學(xué);2010年

2 袁分錢;Hath1基因和DAPT治療大鼠耳聾的初步研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2011年

3 劉清明;TGF～β/Smad5基因敲除小鼠聽生理和耳蝸形態(tài)實驗觀察[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進修學(xué)院;2004年

4 宇雅蘋;SMADs基因在小鼠內(nèi)耳聽覺器官發(fā)育中的信號調(diào)控作用[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進修學(xué)院;2007年

5 郭瑋;NeuroD在大鼠腦發(fā)育過程中的差異性表達(dá)[D];福建醫(yī)科大學(xué);2008年

6 王蕾;老年性耳聾患者內(nèi)皮祖細(xì)胞功能研究[D];鄭州大學(xué);2009年

7 舒衛(wèi)寧;Math1基因?qū)π律笫蠡啄p傷后的實驗研究[D];蘭州大學(xué);2010年

8 王樂;hESC和hiPSC體外定向誘導(dǎo)分化的實驗研究[D];鄭州大學(xué);2012年

9 安國防;針刺對缺氧新生鼠腦NeuroD表達(dá)的影響[D];福建醫(yī)科大學(xué);2012年

10 段晨帆;乙醇對大鼠原代大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP及Plk2表達(dá)的影響[D];大連醫(yī)科大學(xué);2012年

，

本文編號：2475471