發(fā)布時(shí)間：2019-04-18 08:18

【摘要】： 【背景】 隨著工業(yè)化進(jìn)程的加快,感音神經(jīng)性耳聾已逐漸成為影響公眾健康的重要社會(huì)問(wèn)題之一。過(guò)度的噪音暴露可導(dǎo)致內(nèi)耳機(jī)械性和代謝性損傷,嚴(yán)重影響了人類(lèi)的生活質(zhì)量,并且最終可導(dǎo)致噪聲誘導(dǎo)的聽(tīng)力降低甚至缺失。然而,哺乳動(dòng)物耳蝸毛細(xì)胞為特化終末細(xì)胞,損失后其再生能力十分有限,這也是導(dǎo)致永久性聽(tīng)力損失的原因。因此,發(fā)現(xiàn)新的哺乳動(dòng)物內(nèi)耳調(diào)控基因,阻止誘導(dǎo)毛細(xì)胞凋亡的信號(hào)分子很可能為感音神經(jīng)性耳聾的治療帶來(lái)曙光。 原癌基因c-myc是快速早期反應(yīng)基因,其編碼的細(xì)胞核蛋白調(diào)控細(xì)胞周期由G1期進(jìn)入S期。通常認(rèn)為c-myc基因在許多生物過(guò)程中發(fā)揮了重要作用,包括胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化及凋亡等。此外,據(jù)報(bào)道靜止細(xì)胞重返細(xì)胞周期過(guò)程中,c-myc基因起到募集轉(zhuǎn)錄因子的重要功能。該基因雖然如此重要,但在哺乳動(dòng)物耳蝸中的研究卻未見(jiàn)報(bào)道。因此,闡明c-myc基因在耳蝸中的作用為哺乳動(dòng)物耳蝸毛細(xì)胞再生提供新的思路。 【目的】 探討c-myc基因在噪聲條件下對(duì)豚鼠聽(tīng)功能及耳蝸毛細(xì)胞形態(tài)的作用及其可能的分子機(jī)制。 【方法】 構(gòu)建含c-myc基因的腺病毒表達(dá)載體(Ad.c-myc-EGFP),并通過(guò)耳蝸冰凍切片觀察報(bào)告基因表達(dá)和Western blot方法鑒定轉(zhuǎn)染后c-Myc表達(dá)量的變化。于噪聲暴露前4天通過(guò)耳蝸顯微注射術(shù)將Ad.c-myc-EGFP注射入豚鼠耳蝸鼓階內(nèi),并以空白腺病毒載體(Ad. EGFP)做對(duì)照。將各組豚鼠暴露于110 dB SPL的白噪聲,頻譜分析能量集中在0.25-6.4kHz,主要集中在4 kHz左右,8 h/day,連續(xù)7天。分別在噪聲暴露前及噪聲暴露后的第7天通過(guò)聽(tīng)性腦干反應(yīng)(ABR)檢測(cè)豚鼠聽(tīng)功能的情況,并利用基底膜鋪片和掃描電鏡等方法觀察耳蝸毛細(xì)胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)的變化。通過(guò)基因芯片和生物信息學(xué)分析進(jìn)一步探討噪聲對(duì)哺乳動(dòng)物內(nèi)耳基因表達(dá)譜的影響,并利用實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證基因芯片的結(jié)果;通過(guò)Tunel染色評(píng)估凋亡在噪聲性損傷中的作用;利用免疫組化方法觀察篩選到的目標(biāo)基因在耳蝸中的表達(dá)與定位,從而推測(cè)c-myc基因在噪聲條件下可能發(fā)揮作用的分子機(jī)制。 【結(jié)果】 成功構(gòu)建了Ad.c-myc-EGFP腺病毒載體,并證明它可以有效干預(yù)耳蝸內(nèi)c-Myc蛋白的表達(dá)水平。通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察了c-myc基因?qū)Χ伒淖饔?主要表現(xiàn)為:相同噪聲暴露后,Ad.c-myc-EGFP注射組聽(tīng)閾提高顯著低于Ad.EGFP組;Ad.c-myc-EGFP注射組外毛細(xì)胞形態(tài)改變及纖毛缺失率明顯低于Ad.EGFP注射組;掃描電鏡觀察亦表明Ad.c-myc-EGFP注射組外毛細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷程度明顯小于Ad.EGFP對(duì)照組。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步利用基因芯片探討噪聲所致內(nèi)耳分子的變化:噪聲可以導(dǎo)致539個(gè)基因發(fā)生變化,其中279個(gè)基因上調(diào),260個(gè)基因下調(diào)。通過(guò)生物信息學(xué)分析:這些差異基因主要涉及免疫系統(tǒng)、應(yīng)激、生物代謝、節(jié)律調(diào)節(jié)及凋亡等相關(guān)基因。實(shí)時(shí)定量PCR鑒定了差異基因倍數(shù)大于5倍以上以及與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的基因,結(jié)果表明9種基因與基因芯片的趨勢(shì)相一致,上調(diào)的有Reg3b,Lcn2,Nob1,Serpina3n,Hamp,Lbp,C3;下調(diào)的為Myh4,F2。Tunel染色觀察表明:噪聲可以誘導(dǎo)耳蝸內(nèi)、外毛細(xì)胞及螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞發(fā)生凋亡。因此,我們推測(cè)c-myc基因在噪聲條件下對(duì)豚鼠聽(tīng)力及耳蝸毛細(xì)胞損傷的推遲作用很可能是由于c-myc基因上調(diào)了保護(hù)性基因而下調(diào)了誘導(dǎo)耳蝸細(xì)胞凋亡基因的表達(dá)而發(fā)揮作用,但c-myc基因與這9種分子在耳蝸細(xì)胞內(nèi)的具體調(diào)節(jié)方式及作用關(guān)系還有待進(jìn)一步闡明。此外,我們進(jìn)一步利用免疫組化觀察到Nob1基因編碼蛋白在噪聲暴露后大鼠耳蝸內(nèi)呈陽(yáng)性表達(dá),陽(yáng)性細(xì)胞主要集中在螺旋神經(jīng)節(jié)和內(nèi)、外毛細(xì)胞;血管紋細(xì)胞也有少量表達(dá);而噪聲暴露前耳蝸內(nèi)未見(jiàn)Nob1蛋白的明顯表達(dá)。因此,推測(cè)Nob1基因作為轉(zhuǎn)錄因子可能參與耳蝸內(nèi)基因的調(diào)控,是一個(gè)新的內(nèi)耳調(diào)控基因,其作用及功能有待深入研究。 【結(jié)論】 c-myc基因減弱了噪聲誘導(dǎo)的豚鼠聽(tīng)功能損傷及毛細(xì)胞形態(tài)的改變,并可能通過(guò)調(diào)節(jié)Reg3b,Lcn2,Nob1,Serpina3n,Hamp,Lbp,C3,Myh4,F2基因及凋亡相關(guān)分子發(fā)揮作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類(lèi)號(hào)】：R764

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前5條

1 阮芳銘,高文元,王海明,季紅光,趙嵐,崔風(fēng)軍;全耳蝸基底膜硬鋪片法的改進(jìn)和組化觀察[J];海軍醫(yī)學(xué)雜志;2002年02期

2 李華偉,汪吉寶;雛雞聽(tīng)毛細(xì)胞損傷后c-myc mRNA及其產(chǎn)物表達(dá)的研究[J];臨床耳鼻咽喉科雜志;1999年04期

3 亓衛(wèi)東;丁大連;蔣海燕;Richard J Salvi;;全耳蝸毛細(xì)胞定量分析系統(tǒng)[J];聽(tīng)力學(xué)及言語(yǔ)疾病雜志;2007年02期

4 王國(guó)鵬;李澤文;龔樹(shù)生;;感音神經(jīng)性耳聾基因治療的新進(jìn)展[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2007年40期

5 高春生,陳向東;人胎兒內(nèi)耳c-myc、c-fos蛋白的定位表達(dá)[J];中山大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)科學(xué)版);2003年06期

，

本文編號(hào)：2459892