【摘要】： 【背景】 隨著工業(yè)化進程的加快,感音神經性耳聾已逐漸成為影響公眾健康的重要社會問題之一。過度的噪音暴露可導致內耳機械性和代謝性損傷,嚴重影響了人類的生活質量,并且最終可導致噪聲誘導的聽力降低甚至缺失。然而,哺乳動物耳蝸毛細胞為特化終末細胞,損失后其再生能力十分有限,這也是導致永久性聽力損失的原因。因此,發(fā)現(xiàn)新的哺乳動物內耳調控基因,阻止誘導毛細胞凋亡的信號分子很可能為感音神經性耳聾的治療帶來曙光。 原癌基因c-myc是快速早期反應基因,其編碼的細胞核蛋白調控細胞周期由G1期進入S期。通常認為c-myc基因在許多生物過程中發(fā)揮了重要作用,包括胚胎發(fā)育、細胞增殖、分化及凋亡等。此外,據報道靜止細胞重返細胞周期過程中,c-myc基因起到募集轉錄因子的重要功能。該基因雖然如此重要,但在哺乳動物耳蝸中的研究卻未見報道。因此,闡明c-myc基因在耳蝸中的作用為哺乳動物耳蝸毛細胞再生提供新的思路。 【目的】 探討c-myc基因在噪聲條件下對豚鼠聽功能及耳蝸毛細胞形態(tài)的作用及其可能的分子機制。 【方法】 構建含c-myc基因的腺病毒表達載體(Ad.c-myc-EGFP),并通過耳蝸冰凍切片觀察報告基因表達和Western blot方法鑒定轉染后c-Myc表達量的變化。于噪聲暴露前4天通過耳蝸顯微注射術將Ad.c-myc-EGFP注射入豚鼠耳蝸鼓階內,并以空白腺病毒載體(Ad. EGFP)做對照。將各組豚鼠暴露于110 dB SPL的白噪聲,頻譜分析能量集中在0.25-6.4kHz,主要集中在4 kHz左右,8 h/day,連續(xù)7天。分別在噪聲暴露前及噪聲暴露后的第7天通過聽性腦干反應(ABR)檢測豚鼠聽功能的情況,并利用基底膜鋪片和掃描電鏡等方法觀察耳蝸毛細胞形態(tài)及超微結構的變化。通過基因芯片和生物信息學分析進一步探討噪聲對哺乳動物內耳基因表達譜的影響,并利用實時定量PCR驗證基因芯片的結果;通過Tunel染色評估凋亡在噪聲性損傷中的作用;利用免疫組化方法觀察篩選到的目標基因在耳蝸中的表達與定位,從而推測c-myc基因在噪聲條件下可能發(fā)揮作用的分子機制。 【結果】 成功構建了Ad.c-myc-EGFP腺病毒載體,并證明它可以有效干預耳蝸內c-Myc蛋白的表達水平。通過體內實驗觀察了c-myc基因對耳蝸的作用,主要表現(xiàn)為:相同噪聲暴露后,Ad.c-myc-EGFP注射組聽閾提高顯著低于Ad.EGFP組;Ad.c-myc-EGFP注射組外毛細胞形態(tài)改變及纖毛缺失率明顯低于Ad.EGFP注射組;掃描電鏡觀察亦表明Ad.c-myc-EGFP注射組外毛細胞超微結構損傷程度明顯小于Ad.EGFP對照組。本實驗進一步利用基因芯片探討噪聲所致內耳分子的變化:噪聲可以導致539個基因發(fā)生變化,其中279個基因上調,260個基因下調。通過生物信息學分析:這些差異基因主要涉及免疫系統(tǒng)、應激、生物代謝、節(jié)律調節(jié)及凋亡等相關基因。實時定量PCR鑒定了差異基因倍數大于5倍以上以及與免疫調節(jié)相關的基因,結果表明9種基因與基因芯片的趨勢相一致,上調的有Reg3b,Lcn2,Nob1,Serpina3n,Hamp,Lbp,C3;下調的為Myh4,F2。Tunel染色觀察表明:噪聲可以誘導耳蝸內、外毛細胞及螺旋神經節(jié)細胞發(fā)生凋亡。因此,我們推測c-myc基因在噪聲條件下對豚鼠聽力及耳蝸毛細胞損傷的推遲作用很可能是由于c-myc基因上調了保護性基因而下調了誘導耳蝸細胞凋亡基因的表達而發(fā)揮作用,但c-myc基因與這9種分子在耳蝸細胞內的具體調節(jié)方式及作用關系還有待進一步闡明。此外,我們進一步利用免疫組化觀察到Nob1基因編碼蛋白在噪聲暴露后大鼠耳蝸內呈陽性表達,陽性細胞主要集中在螺旋神經節(jié)和內、外毛細胞;血管紋細胞也有少量表達;而噪聲暴露前耳蝸內未見Nob1蛋白的明顯表達。因此,推測Nob1基因作為轉錄因子可能參與耳蝸內基因的調控,是一個新的內耳調控基因,其作用及功能有待深入研究。 【結論】 c-myc基因減弱了噪聲誘導的豚鼠聽功能損傷及毛細胞形態(tài)的改變,并可能通過調節(jié)Reg3b,Lcn2,Nob1,Serpina3n,Hamp,Lbp,C3,Myh4,F2基因及凋亡相關分子發(fā)揮作用。
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【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R764

【參考文獻】

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1 阮芳銘,高文元,王海明,季紅光,趙嵐,崔風軍;全耳蝸基底膜硬鋪片法的改進和組化觀察[J];海軍醫(yī)學雜志;2002年02期

2 李華偉,汪吉寶;雛雞聽毛細胞損傷后c-myc mRNA及其產物表達的研究[J];臨床耳鼻咽喉科雜志;1999年04期

3 亓衛(wèi)東;丁大連;蔣海燕;Richard J Salvi;;全耳蝸毛細胞定量分析系統(tǒng)[J];聽力學及言語疾病雜志;2007年02期

4 王國鵬;李澤文;龔樹生;;感音神經性耳聾基因治療的新進展[J];中華醫(yī)學雜志;2007年40期

5 高春生,陳向東;人胎兒內耳c-myc、c-fos蛋白的定位表達[J];中山大學學報(醫(yī)學科學版);2003年06期

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本文編號：2459892