【摘要】：第一部分15-脂氧合酶-1基因重組腺病毒的構(gòu)建、包裝、鑒定及表達 目的：構(gòu)建攜帶增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)標(biāo)簽表達小鼠15-脂氧合酶-1(15-lipoxygenase-1,15-LOX-1)基因的重組腺病毒載體。 方法：從含有小鼠15-LOX-1基因的cDNA文庫中,利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)獲取并擴增15-LOX-1基因,將擴增后的產(chǎn)物定向克隆至真核表達載體pDC315-EGFP構(gòu)建穿梭質(zhì)粒pDC315-15-LOX-1-EGFP.將構(gòu)建成功的攜帶EGFP標(biāo)簽的穿梭質(zhì)粒pDC315-15-LOX-1-EGFP與腺病毒骨架質(zhì)粒pBHGlox-ΔE1,3Ere共轉(zhuǎn)染HEK293細胞,經(jīng)位點特異重組得到重組腺病毒Ad-15-LOX-1-EGFP。通過觀察HEK293細胞中EGFP的表達和免疫印跡法(Western blot)檢測15-LOX-1蛋白的表達來鑒定重組腺病毒Ad-15-LOX-1-EGFP。經(jīng)反復(fù)感染HEK293細胞擴增病毒后,利用Adeno-XTM腺病毒純化試劑盒純化病毒,終點稀釋法測定病毒滴度。 結(jié)果：Western blot檢測和EGFP表達觀察證明已成功構(gòu)建攜帶EGFP標(biāo)簽表達小鼠15-LOX-1基因的重組腺病毒Ad-15-LOX-1-EGFP;經(jīng)過擴增純化后,測得其病毒滴度為1.25×1011PFU/ml. 結(jié)論：應(yīng)用細胞內(nèi)同源重組的方法成功構(gòu)建了攜帶EGFP標(biāo)簽表達小鼠15-LOX-1基因的重組腺病毒載體Ad-15-LOX-1-EGFP。 第二部分15-脂氧合酶-1在氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變小鼠模型的表達研究 目的：通過氧環(huán)境的變化誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生新生血管,建立氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變(oxygen induced retinopathy, OIR)模型。探討15-酯氧合酶-1(15-LOX-1)在視網(wǎng)膜新生血管形成過程中的表達及其意義。 方法：將186只7日齡C57BL/6J小鼠隨機分成正常對照組和誘導(dǎo)模型組。正常對照組置于正常環(huán)境溫度下飼養(yǎng)；誘導(dǎo)模型組置于氧濃度為(75±2)%的密閉環(huán)境中飼養(yǎng)5天后轉(zhuǎn)移至正常環(huán)境溫度下再飼養(yǎng)5天,建立OIR模型。取兩組17日齡小鼠眼球做石蠟包埋切片,行蘇木精-伊紅(HE)染色并計數(shù)突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細胞核數(shù)目；取兩組17日齡小鼠應(yīng)用視網(wǎng)膜熒光血管造影觀察視網(wǎng)膜血管的形態(tài)學(xué)變化和新生血管的形成。分別于7日齡、9日齡、12日齡、14日齡、17日齡和21日齡將上述兩組小鼠處死,用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-Time PCR)和免疫印跡法(Western Blot)分別檢測15-LOX-1在正常對照組視網(wǎng)膜和誘導(dǎo)模型組視網(wǎng)膜新生血管形成過程中的表達情況。 結(jié)果：視網(wǎng)膜熒光血管造影鋪片結(jié)果顯示在誘導(dǎo)模型組小鼠視網(wǎng)膜中有大量新生血管生成,其結(jié)構(gòu)和分布紊亂；HE染色計數(shù)突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細胞核數(shù)目誘導(dǎo)模型組與正常對照組相比,數(shù)量明顯增加且差異具有顯著性(P0.01)。Real-Time PCR和Western Blot結(jié)果顯示在誘導(dǎo)模型組視網(wǎng)膜新生血管形成過程中15-LOX-1的mRNA和蛋白表達水平均明顯降低,與正常對照組的差異均具有顯著性(P0.05;p0.05),并且15-LOX-1的表達變化與視網(wǎng)膜新生血管的形成呈相反的趨勢。 結(jié)論：研究結(jié)果表明在OIR小鼠模型中,15-LOX-1呈明顯低表達,并且15-LOX-1的表達變化與視網(wǎng)膜新生血管的形成呈相反的趨勢。15-LOX-1有可能是治療視網(wǎng)膜新生血管性疾病的新靶點。 第三部分15-脂氧合酶-1基因轉(zhuǎn)移抑制氧誘導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜新生血管的作用及其機制研究 目的：探討15-脂氧合酶-1(15-LOX-1)基因轉(zhuǎn)移抑制氧誘導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜新生血管的作用及其機制。 方法：將108只7日齡C57BL/6J小鼠隨機分為正常對照組、誘導(dǎo)模型組、基因治療組和空白載體組。將小鼠與哺乳母鼠共同置于氧濃度為(75±2)%的氧箱內(nèi)飼養(yǎng)5天后轉(zhuǎn)移至正常氧環(huán)境中飼養(yǎng)5天建立氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變(oxygen induced retinopathy, OIR)模型。小鼠出生后12天基因治療組玻璃體腔注射Ad-15-LOX-1-EGFP1.0μl;空白載體組注射等量Ad-EGFP。注射后第2天行視網(wǎng)膜鋪片熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達。注射后第5天行免疫熒光染色法檢測15-LOX-1基因轉(zhuǎn)染視網(wǎng)膜的表達；行實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)和免疫印跡法分別檢測視網(wǎng)膜15-LOX-1、過氧化物酶增殖活化受體γ(PPAR-y)、血管內(nèi)皮生長因子-A(VEGF-A)及血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFR-2)的mRNA和蛋白表達；行FITC-dextran熒光素造影視網(wǎng)膜鋪片觀察并測量視網(wǎng)膜無灌注區(qū)和新生血管的相對面積；行石蠟切片蘇木精-伊紅染色計數(shù)突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細胞核數(shù)目。采用單因素方差分析及Bonferroni post檢驗進行各組間的數(shù)據(jù)比較。 結(jié)果：腺病毒Ad-15-LOX-1-EGFP注射2天后,在視網(wǎng)膜鋪片上通過熒光顯微鏡觀察到綠色熒光蛋白的表達。免疫熒光染色結(jié)果顯示15-LOX-1基因轉(zhuǎn)染視網(wǎng)膜主要表達在外叢狀層、內(nèi)核層和神經(jīng)節(jié)細胞層。基因治療組15-LOX-1和PPAR-γ mRNA及蛋白表達水平明顯高于誘導(dǎo)模型組和空白載體組(P0.01；P0.01);與之相反,基因治療組VEGF-A和VEGFR-2mRNA及蛋白表達水平明顯低于誘導(dǎo)模型組和空白載體組(P0.01；P0.01)。基因治療組中視網(wǎng)膜無灌注區(qū)和新生血管面積均較誘導(dǎo)模型組和空白載體組顯著減小(P0.01;P0.01);基因治療組中突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細胞核數(shù)目與誘導(dǎo)模型組和空白載體組比較亦明顯減少(P0.01；P0.01)。 結(jié)論：15-LOX-1基因轉(zhuǎn)移不僅可以減少氧誘導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜無灌注區(qū)面積,并且對視網(wǎng)膜新生血管有顯著的抑制作用。15-LOX-1基因轉(zhuǎn)移可能通過上調(diào)PPAR-γ,下調(diào)VEGF-A和VEGFR-2的表達發(fā)揮抑制視網(wǎng)膜新生血管的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R774.1

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本文編號：2448531