【摘要】： 目的:目前研究已證實(shí)CD133是人喉癌細(xì)胞系Hep-2中腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志物,表達(dá)CD133+的細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞的特性。本試驗(yàn)擬通過(guò)研究放射治療后的人喉癌細(xì)胞系Hep-2,檢測(cè)其CD133+細(xì)胞比例、細(xì)胞增殖抑制率及細(xì)胞周期分布情況,發(fā)現(xiàn)檢測(cè)指標(biāo)的變化特點(diǎn)及各指標(biāo)之間的關(guān)系。探討放射治療對(duì)喉癌腫瘤干細(xì)胞的影響,驗(yàn)證腫瘤干細(xì)胞是否存在放療抵抗的特性,明確腫瘤干細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞放療抵抗現(xiàn)象中的作用。為進(jìn)一步研究頭頸部腫瘤干細(xì)胞放療抵抗特性及其更深層次機(jī)理做初步探索研究,為今后發(fā)現(xiàn)以腫瘤干細(xì)胞為靶點(diǎn)治療頭頸部腫瘤的新途徑尋找實(shí)驗(yàn)方法。 方法:復(fù)蘇人喉癌細(xì)胞系Hep-2細(xì)胞,在37℃、5%CO2、20%O2、飽和濕度條件下的濕潤(rùn)恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,給予不同劑量的放射治療處理后,分別用于以下實(shí)驗(yàn): 1.倒置熒光顯微鏡下觀察Hep-2細(xì)胞接受不同劑量60Co放療作用后細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變及特點(diǎn)。 2.應(yīng)用MTT法檢測(cè)人喉癌細(xì)胞系Hep-2在接受放射治療處理后的細(xì)胞增殖抑制率,發(fā)現(xiàn)其放射治療處理后的增殖生長(zhǎng)規(guī)律。 3.應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)人喉癌細(xì)胞系Hep-2腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD133的表達(dá)情況。比較不同檢測(cè)點(diǎn)CD133+細(xì)胞比例的差異。篩選CD133+細(xì)胞比例最高的放療劑量和檢測(cè)時(shí)間點(diǎn),為后續(xù)試驗(yàn)尋找最佳觀測(cè)條件提供參考。 4.應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)(PI法)人喉癌細(xì)胞系Hep-2在接受20Gy的放射治療處理后,細(xì)胞周期分布情況,發(fā)現(xiàn)其放射治療處理后細(xì)胞周期的變化特點(diǎn)。 最后將上述試驗(yàn)觀察的現(xiàn)象和檢測(cè)測(cè)得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和比較,通過(guò)尋找各項(xiàng)指標(biāo)間的特點(diǎn)和規(guī)律,探討腫瘤干細(xì)胞與放療抵抗現(xiàn)象的關(guān)系。 結(jié)果: 1.倒置熒光顯微鏡下定時(shí)觀察,發(fā)現(xiàn)Hep-2細(xì)胞接受放射治療后出現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化。首先細(xì)胞由正常的多角梭形逐漸變圓,折光性增強(qiáng),而后出現(xiàn)為細(xì)胞體積變小,胞漿內(nèi)出現(xiàn)凋亡小體,核分裂相少見(jiàn),細(xì)胞貼壁差,最后細(xì)胞漂浮崩解,呈典型細(xì)胞凋亡過(guò)程。發(fā)生凋亡的細(xì)胞數(shù)量和凋亡細(xì)胞變化的程度與放射劑量存在劑量依賴(lài)關(guān)系。 2.MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)人喉癌細(xì)胞系Hep-2在接受放射治療處理后,均出現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制的情況。表現(xiàn)為細(xì)胞增殖抑制率隨放射劑量增大而升高,存在劑量依賴(lài)關(guān)系;放射治療后細(xì)胞增殖抑制率升高趨勢(shì)逐漸減緩,細(xì)胞增殖受抑制現(xiàn)象逐漸減弱,細(xì)胞增殖能力逐漸恢復(fù)。 3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)人喉癌細(xì)胞系Hep-2經(jīng)不同劑量放射治療后,各組均出現(xiàn)表達(dá)CD133+細(xì)胞比例增高的現(xiàn)象。表現(xiàn)為在一定劑量范圍內(nèi)(0Gy~20Gy)CD133+細(xì)胞比例與放射劑量成正相關(guān)關(guān)系(r=0.22,p0.05),超過(guò)這一范圍(25Gy)CD133+細(xì)胞比例出現(xiàn)下降趨勢(shì);放療后表達(dá)CD133+細(xì)胞比例表現(xiàn)為先升高后降低的變化規(guī)律,上升到48h最高比例點(diǎn)后出現(xiàn)下降趨勢(shì)。CD133+細(xì)胞比例最高的為20Gy組放療后48h時(shí)間點(diǎn)測(cè)得為2.70%±0.13%,表示20Gy和48h可作為最適宜觀察條件,后續(xù)試驗(yàn)可以選擇20Gy組和48h時(shí)間點(diǎn)為代表進(jìn)行試驗(yàn)。 4.應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)PI法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),接受放射治療后的人喉癌細(xì)胞系Hep-2細(xì)胞周期分布發(fā)生改變。人喉癌細(xì)胞系Hep-2在接受20Gy的放射治療處理后,出現(xiàn)G0/G1阻滯現(xiàn)象,G0/G1比例最高出現(xiàn)在放療后48h(68.2%±4.16%),比例變化趨勢(shì)為先增加后降低。 結(jié)論: 1.經(jīng)60Co放射治療后的人喉癌細(xì)胞系Hep-2形態(tài)學(xué)變化明顯,符合細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特點(diǎn); 2.經(jīng)60Co放射治療后的人喉癌細(xì)胞系Hep-2出現(xiàn)了CD133+細(xì)胞比例增加的現(xiàn)象,是Hep-2-CSC放療抵抗的直接征象,為證明喉癌腫瘤干細(xì)胞存在放療抵抗特性提供了依據(jù); 3.在一定劑量范圍內(nèi)(0~20Gy),腫瘤干細(xì)胞比例與放射劑量存在正相關(guān),腫瘤干細(xì)胞比例最高點(diǎn)為照射20Gy后48h時(shí),可作為今后試驗(yàn)最適宜觀察條件; 4.人喉癌細(xì)胞系Hep-2在接受放射治療后CD133+細(xì)胞比例變化特點(diǎn)為先增高后降低,可能是腫瘤干細(xì)胞先由于放療抵抗出現(xiàn)比率升高,而后腫瘤干細(xì)胞分化為非腫瘤干細(xì)胞又導(dǎo)致比例降低; 5.人喉癌細(xì)胞系Hep-2在接受放射治療后細(xì)胞增殖能力下降后逐漸恢復(fù),其可能的原因是腫瘤干細(xì)胞由于其放療抵抗特性和自我更新分化能力的作用,使腫瘤細(xì)胞恢復(fù)增殖能力;尚不能確定G0/G1阻滯和比例變化是否與腫瘤干細(xì)胞有關(guān),可后續(xù)進(jìn)行腫瘤干細(xì)胞分選進(jìn)一步研究。 6.以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,人喉癌細(xì)胞系Hep-2中存在亞群細(xì)胞有放療抵抗特性,為腫瘤干細(xì)胞亞群,并與腫瘤增殖抑制率、細(xì)胞周期變化存在可能的聯(lián)系,后續(xù)實(shí)驗(yàn)可深入研究其分子機(jī)制。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類(lèi)號(hào)】：R739.6

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2429239