【摘要】： 研究背景和目的 鼻咽癌(NasoPharyngeal Carcinoma,NPC)是我國南方五省及東南亞地區(qū)高發(fā)的頭頸部惡性腫瘤之一,它的發(fā)病是一個多基因參與、多途徑作用、多階段逐漸演變的過程,涉及了一些關(guān)鍵的瘤基因和抑瘤基因,但其發(fā)病的分子機制仍未闡明。目前,普遍認(rèn)為EB病毒感染、遺傳因素和化學(xué)致癌物是導(dǎo)致鼻咽癌發(fā)生的三大主要原因。 腫瘤的致瘤性和轉(zhuǎn)移性往往是在臨床治療的過程中最難攻克的難關(guān),也引起了無數(shù)腫瘤基礎(chǔ)研究者的濃厚興趣和深入研究。那么在鼻咽癌的成瘤和轉(zhuǎn)移的過程中,到底有哪些基因影響了鼻咽癌的成瘤,而又有哪些基因和通路在鼻咽癌轉(zhuǎn)移的過程中起到了重要作用?既往的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些瘤基因、抑瘤基因、轉(zhuǎn)移促進基因和轉(zhuǎn)移抑制基因,但我們相信在鼻咽癌中起作用的遠(yuǎn)遠(yuǎn)不止這些。所以課題組擬通過生物信息學(xué)的方法來繼續(xù)尋找潛在的瘤基因并用實驗進行驗證,同時挖掘鼻咽癌的轉(zhuǎn)移相關(guān)基因及調(diào)控通路。 在課題組早期的工作中,黃仲曦副教授結(jié)合鼻咽癌細(xì)胞株的SNP芯片和表達譜芯片,在鼻咽癌的早期事件12p12-11擴增區(qū)域中找到了在鼻咽癌細(xì)胞株中一致擴增而相對于NP69一致過表達的基因,即PTHLH。接著用熒光定量PCR對細(xì)胞株中PTHLH的拷貝數(shù)和表達進行驗證,實驗結(jié)果與芯片結(jié)果大體一致。對17例鼻咽癌組織進行RT-PCR,結(jié)果顯示PTHLH在64.7%的鼻咽癌組織中表達上調(diào)。免疫組化顯示PTHLH在83%的鼻咽癌組織中表達上調(diào)�；谶@些實驗結(jié)果把PTHLH定為是一個候選的鼻咽癌瘤基因。因此,在本課題第一部分中,我們擬通過分子生物學(xué)實驗來驗證PTHLH在鼻咽癌細(xì)胞株中的致瘤能力。 關(guān)于鼻咽癌轉(zhuǎn)移機制研究,已經(jīng)有一些轉(zhuǎn)移相關(guān)基因和通路被發(fā)現(xiàn)和證實,但是其機制仍然不是十分清楚,我們相信還有更多的轉(zhuǎn)移相關(guān)基因有待挖掘和驗證。在本課題的第二步研究中,我們擬通過鼻咽癌細(xì)胞株5-8F和16-10B來挖掘與鼻咽癌轉(zhuǎn)移特性密切相關(guān)的基因。 鼻咽癌細(xì)胞株5-8F和6-10B均來自同一母細(xì)胞株SUNE-1,既往的研究已經(jīng)證實,5-8F具有高成瘤、高轉(zhuǎn)移能力,而6-10B則只成瘤、不轉(zhuǎn)移。先前也已有一些基于這兩個細(xì)胞株的差異轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等高通量研究報道。但是過去的高通量研究具有明顯的局限性,通常只檢測了人類大約25,000個基因中的不到8,000個�？紤]到過去高通量研究方法處理量的局限性,我們擬通過全基因組微陣列技術(shù)來更加全面地研究5-8F和6-10B細(xì)胞株的生物學(xué)特性,挖掘出它們之間的差異表達基因和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因并進行初步分析。 方法 1.靶基因PTHLH在鼻咽癌細(xì)胞株中的表達特性鑒定 采用熒光定量PCR法和Western blot,分別從mRNA水平和蛋白水平檢測PTHLH在永生化鼻咽上皮細(xì)胞NP69和鼻咽癌細(xì)胞5-8F、6-10B、CNE1、CNE2、HONE1中的表達水平,初步探討PTHLH在永生化鼻咽上皮細(xì)胞和鼻咽癌細(xì)胞中的表達差異,結(jié)合芯片數(shù)據(jù),找到高表達PTHLH的鼻咽癌細(xì)胞株作為下一步干擾對象。 2. PTHLH表達沉默對鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)影響 構(gòu)建靶基因PTHLH的慢病毒干擾、陰性對照載體,包裝成成熟的慢病毒顆粒感染高表達PTHLH的6-10B細(xì)胞,通過有限稀釋法,倒置熒光顯微鏡下挑取單克隆的方法篩選出穩(wěn)定的陽性和空載克隆,熒光定量PCR檢測各干擾克隆細(xì)胞中PTHLH干擾效率,篩選干擾效率最高的細(xì)胞克隆作為實驗對象進行后續(xù)實驗研究。MTT法、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期及平板克隆形成實驗檢測PTHLH沉默后對細(xì)胞體外增殖的影響；Transwell檢測PTHLH沉默后細(xì)胞遷移運動和侵襲能力的改變。 3.鼻咽癌細(xì)胞株5-8F和6-10B差異表達基因的微陣列分析 我們通過提供5-8F和6-10B細(xì)胞株的mRNA樣本,交由公司制作表達譜芯片,采用的是Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0微陣列(包含54,675個探針集,幾乎涵蓋了人類基因組的所有基因)通過三次生物學(xué)重復(fù)檢測這兩個細(xì)胞株,采用近期發(fā)表的兩個軟件來挖掘轉(zhuǎn)移相關(guān)基因及其分子機制。其一是GOEAST(Gene Ontology Enrichment Analysis Software Toolkithttp://www.omicslab .genetics.ac.cn/GOEAST/),用來分析差異表達基因主要參與的生物學(xué)過程和分子功能。其二是GenCLiP(http://www.genclip.com),通過挖掘文獻進行基因聚類和構(gòu)建基因共發(fā)生網(wǎng)絡(luò),揭示差異表達基因參與的發(fā)病分子機理、基因網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控通路。 4.統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學(xué)處理,熒光定量PCR法檢測鼻咽癌細(xì)胞株P(guān)THLH表達特性結(jié)果比較采用單因素方差分析,多重比較采用SNK檢驗。第二章中熒光定量PCR、運動、侵襲實驗、平板克隆形成實驗和細(xì)胞周期采用單因素方差分析；MTT采用析因設(shè)計的方差分析；多重比較采用SNK檢驗。 結(jié)果 1.靶基因PTHLH在鼻咽癌細(xì)胞株中的表達特性鑒定 1)熒光定量PCR法檢測PTHLH在永生化鼻咽上皮細(xì)胞NP69和鼻咽癌細(xì)胞5-8F、6-10B、CNE1、CNE2、HONE1表達水平,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=100.473,P=0.000),6-10B和HONE1表達最高。 2) Western blot檢測PTHLH在鼻咽癌細(xì)胞株5-8F、6-10B、CNE1、CNE2、HONE1中的蛋白表達水平,應(yīng)用Image-Pro Plus圖像分析軟件計算各條帶的光密度值,計算各細(xì)胞株的PTHLH表達率。結(jié)果顯示PTHLH在6-10B、HONE1中高表達。選擇6-10B作為干擾的靶細(xì)胞株進行后續(xù)試驗。 2. PTHLH表達沉默對鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)影響 1)構(gòu)建慢病毒干擾載體和陰性對照載體,包裝慢病毒后感染6-10B細(xì)胞,有限稀釋法于倒置熒光顯微鏡下挑取GFP+單克隆,熒光定量PCR檢測各克隆的PTHLH表達情況,篩選出干擾效率最高的克隆2(94.1%)為下一步實驗的研究對象。陽性克隆的干擾效率與6-10B和陰性對照細(xì)胞表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=59.833,P=0.000),同時檢測PTHLH在陰性對照中的表達相對于6-10B強度較一致(0.809±0.187)。陽性干擾克隆命名為6-1 OB/PLVTHM-PTHLH,陰性對照克隆為6-10B/PLVTHM。 2)MTT法檢測細(xì)胞增殖情況,與陰性對照6-10B/PLVTHM和6-10B細(xì)胞相比,干擾克隆細(xì)胞6-1 OB/PLVTHM-PTHLH的增殖速度明顯減慢并且呈時間依賴關(guān)系,有統(tǒng)計學(xué)差異(F=65526.028,P=0.000)；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明各組細(xì)胞中G1期、S期和G2／M期差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P值分別為0.132、0.076、0.109)；平板克隆形成實驗顯示三組細(xì)胞的克隆形成率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=118.940,P=0.000),6-1 OB/PLVTHM-PTHLH細(xì)胞克隆形成減少,6-10B和陰性對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.345)。綜合表明PTHLH表達干擾后,6-10B細(xì)胞體外生長被抑制。 3)Transwell小室檢測結(jié)果顯示,與6-10B和6-10B/PLVTHM細(xì)胞相比,6-10B/PLVTHM-PTHLH細(xì)胞穿過聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù)減少,差異具有顯著性(F=1966.153,P=0.000)。說明PTHLH表達沉默降低了6-10B細(xì)胞的體外運動能力。 4)用熒光定量PCR法檢測PTHLH沉默后細(xì)胞株中DKK1及b-catenin基因的表達水平的改變,結(jié)果顯示相對于6-10B及陰性對照細(xì)胞株,干擾后的細(xì)胞株DKK1及b-catenin的表達水平未出現(xiàn)明顯改變,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.104P=0.903／F=0.210 P=0.816)。 3.鼻咽癌細(xì)胞株5-8F和6-10B差異表達基因的微陣列分析 通過分析表達譜芯片數(shù)據(jù),篩選出了60個差異表達基因,并在這60個基因中選取8個基因進行了熒光定量PCR驗證,實驗結(jié)果與芯片結(jié)果具有高度的一致性,驗證了芯片結(jié)果的可靠性。用在線軟件GOEAST對差異表達基因進行分析,發(fā)現(xiàn)大部分差異表達基因參與了細(xì)胞和代謝過程,具有催化活性、離子結(jié)合能力和蛋白結(jié)合能力。將差異表達基因與所感興趣的關(guān)鍵詞進行聚類分析,發(fā)現(xiàn)這些基因與凋亡、細(xì)胞周期、轉(zhuǎn)移、趨化因子和免疫編輯特異相關(guān)。以“轉(zhuǎn)移”為關(guān)鍵詞構(gòu)建基因網(wǎng)絡(luò)圖,發(fā)現(xiàn)差異表達基因中有42個為轉(zhuǎn)移相關(guān)基因(P0,00001)1其中11個基因形成了7個基因?qū)?P=0=013)。在轉(zhuǎn)移相關(guān)網(wǎng)絡(luò)圖中發(fā)一現(xiàn)了在本課題中進行驗證的候選瘤基因PTHLH,和DKK1有著某種聯(lián)系。在研究PTHLH-DKK1-Wnt通路中,推測DKK1對Wnt通路的抑制作用可能是導(dǎo)致6-10B低轉(zhuǎn)移的原因,而實驗結(jié)果證實PTHLH對DKKl并沒有起到單獨的抑制作用。 結(jié)論 1.熒光定量PCR法和Western blot檢測PTHLH在鼻咽癌細(xì)胞5-8F、6-10B、CNE1、CNE2中的mRNA和蛋白水平的表達均有差異,6-10B和HONE1表達最高。選擇高成瘤細(xì)胞株6-10B為進一步干擾對象。 2.利用慢病毒載體和RNAi技術(shù)建立了PTHLH表達穩(wěn)定下調(diào)的6-10B細(xì)胞株,干擾后細(xì)胞體內(nèi)、外生物學(xué)功能發(fā)生較明顯的改變。PTHLH表達下調(diào)抑制了6-10B細(xì)胞株的生長和侵襲。說明PTHLH在6-10B細(xì)胞株的高成瘤中起到了一定的促進作用。 3.在不同轉(zhuǎn)移特性的細(xì)胞株5-8F和6-10B之間篩選出60個差異表達基因,參與細(xì)胞和代謝過程,與凋亡、細(xì)胞周期、轉(zhuǎn)移、趨化因子和免疫編輯特異相關(guān)。找出了42個轉(zhuǎn)移相關(guān)基因,構(gòu)建了轉(zhuǎn)移相關(guān)基因網(wǎng)絡(luò)圖。在研究PTHLH和DKK1-Wnt通路中,推測DKK1可能通過調(diào)節(jié)Wnt通路影響鼻咽癌的轉(zhuǎn)移。而DKK1的活性不單獨受PTHLH的影響。PTHLH能夠促進鼻咽癌細(xì)胞株6-10B的成瘤,但是與5-8F和6-10B的轉(zhuǎn)移特性無關(guān)。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R739.63

【參考文獻】

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本文編號：2416561