【摘要】：視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells, RGCs)的凋亡是青光眼等眼科疾病的重要病理特征之一,也是導(dǎo)致青光眼視野缺損的主要原因。RGC-5細(xì)胞系是目前作為青光眼體外實驗?zāi)Ｐ偷囊粋�重要細(xì)胞系。谷氨酸是視網(wǎng)膜的主要興奮性遞質(zhì),正常情況下不引起毒性。但在眼壓升高等原因?qū)е乱暰W(wǎng)膜缺血缺氧時,谷氨酸會大量釋放,對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。谷氨酸的過度表達(dá)是導(dǎo)致RGCs凋亡的重要原因。因此,利用谷氨酸誘導(dǎo)的RGC-5凋亡可以作為研究視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡及視神經(jīng)保護(hù)的模型。 氯離子是生物體內(nèi)含量最豐富的陰離子,通過跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和離子通道參與機(jī)體多種生物功能。電壓門控性氯通道(voltage-gated chloride channnel,CIC)在哺乳動物細(xì)胞中廣泛表達(dá),ClC-3氯離子通道作為此家族中的一個亞型,是目前研究較為廣泛和明確的一種氯離子通道類型,與多種生理功能的調(diào)節(jié)有關(guān)。關(guān)于ClC參與細(xì)胞凋亡過程已得到廣泛證實。轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factorβ, TGF-β)是一種多功能的細(xì)胞間信號蛋白,在眼部多個組織中表達(dá),并在多種眼科疾病中發(fā)揮作用。TGF-β言號從細(xì)胞膜轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)而發(fā)揮調(diào)控基因表達(dá)的作用,此過程需要依賴Smads家族蛋白的調(diào)節(jié)。TGF-β/Smads信號通路在許多臨床疾病中發(fā)揮作用,也參與了多種細(xì)胞的凋亡過程。在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)Smad蛋白共有8種,其中參與TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要有Smad2、Smad3、Smad4及Smad7。 鑒于此,實驗以谷氨酸誘導(dǎo)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡作為研究對象,應(yīng)用cDNA轉(zhuǎn)染和RNAi方法改變細(xì)胞內(nèi)ClC-3的表達(dá),觀察細(xì)胞凋亡情況及轉(zhuǎn)化生長因子β2、Smads2、Smads3、Smads4、Smads7的表達(dá)變化,以探討ClC-3及TGF-β/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在此過程中的作用。 實驗中首先應(yīng)用RT-PCR的方法證實了RGC-5細(xì)胞中存在ClC-2、ClC-3、ClC-5、TGF-β1及TGF-β2 mRNA的表達(dá),并發(fā)現(xiàn)TGF-β2表達(dá)含量明顯高于TGF-β1；然后應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色的方法證實了ClC-3蛋白在RGC-5細(xì)胞中存在表達(dá),并定位于細(xì)胞漿,為進(jìn)一步實驗提供了基礎(chǔ)和依據(jù)。 文獻(xiàn)報道當(dāng)谷氨酸刺激濃度為1mM時,RGC-5細(xì)胞的凋亡率大約為20%,是比較適宜的研究濃度,因此我們將傳代后的細(xì)胞貼壁生長24h后,加入含有1mM谷氨酸的無血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24h,從而得到RGC-5細(xì)胞凋亡的模型。 進(jìn)一步實驗以谷氨酸誘導(dǎo)的RGC-5細(xì)胞凋亡為研究對象,應(yīng)用ClC-3 cDNA技術(shù)成功轉(zhuǎn)染細(xì)胞,使細(xì)胞內(nèi)ClC-3的mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)均明顯升高,應(yīng)用MTT法、DNA ladder及流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡情況。MTT法結(jié)果顯示細(xì)胞的存活率明顯上升,DNA ladder及流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明凋亡率下降,以上結(jié)果提示ClC-3的過表達(dá)對谷氨酸誘導(dǎo)的RGC-5細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用。 隨后實驗應(yīng)用RNAi技術(shù)轉(zhuǎn)染谷氨酸誘導(dǎo)的RGC-5細(xì)胞,RT-PCR及Western blot結(jié)果證實ClC-3的mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)均被明顯抑制,應(yīng)用MTT法、DNA ladder及流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡情況。MTT法結(jié)果顯示細(xì)胞的存活率明顯下降,DNA ladder及流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明凋亡率明顯上升,結(jié)果證實了抑制ClC-3的表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。以上兩部分實驗從正反兩方面提示ClC-3氯通道對谷氨酸誘導(dǎo)的RGC-5細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用。 應(yīng)用RNAi技術(shù)抑制ClC-3的表達(dá)后,細(xì)胞的凋亡率增加,為了進(jìn)一步檢測TGF-β/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在上述過程中所起的作用,我們應(yīng)用RT-PCR及Western blot的方法,檢測TGF-β2.Smad2.Smad3.Smad4. Smad7 mRNA及蛋白含量的變化情況,發(fā)現(xiàn)TGF-β2及Smad2.Smad3. Smad4.Smad7 mRNA及蛋白表達(dá)均有不同程度的增加,提示TGF-p/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能在谷氨酸誘導(dǎo)的RGC-5細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮作用。 本實驗探討了在谷氨酸誘導(dǎo)的RGC-5細(xì)胞凋亡過程中,ClC-3氯離子通道及TGF-p/Smad信號通路的作用,并得出結(jié)論：ClC-3氯通道對谷氨酸誘導(dǎo)的RGC-5細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用,而TGF-p/Smad信號通路可能參與此過程。提示ClC-3氯通道及TGF-p/Smad信號通路可能成為視神經(jīng)保護(hù)一個新靶點,為進(jìn)一步研究青光眼的發(fā)病機(jī)制及視神經(jīng)保護(hù)提供了理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R775

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本文編號：2404892