發(fā)布時(shí)間：2019-01-02 14:35

【摘要】：第一部分：組蛋白乙�；�/去乙�；富钚栽诒窍⑷庵械淖兓� 目的：評(píng)估組蛋白乙�；�(histone acetyltransferases HATs)和組蛋白去乙�；�(histone deacetyltransferases HDACs)活性在鼻息肉組織中的變化,并檢測(cè)HDACs基因在鼻息肉組織中的表達(dá)變化。 方法：收集2012年6月-2012年11月期間復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院鼻息肉和正常鼻黏膜組織標(biāo)本,提取新鮮組織的核蛋白,分別利用HATs和]HDACs活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)組織核蛋白HATs和HDACs活性,同時(shí)通過(guò)免疫組化的方法比較組蛋白乙�；潭仍诒窍⑷夂驼１丘つぶ械牟町�；另外,提取鼻息肉和正常鼻黏膜組織總RNA,利用熒光定量PCR方法檢測(cè)HDACs基因在鼻息肉和正常鼻黏膜組織表達(dá)變化。 結(jié)果：收集新鮮鼻息肉標(biāo)本20例,正常鼻黏膜標(biāo)本6例;成功提取新鮮組織的核蛋白。HATs和HDACs活性檢測(cè)結(jié)果顯示在正常鼻黏膜中,HAT/HDAC為1.19±0.33,鼻息肉組織中HAT/HDAC為1.95±0.57(P0.01),提示鼻息肉中存在HAT/HDAC失平衡。HDACs活性檢測(cè)顯示鼻息肉中HDACs活性為0.164±0.07/80ug,明顯低于正常鼻黏膜組織HDACs活性(0.35±0.08/80ug)(P0.01),HATs活性未見(jiàn)顯著差異；免疫組化結(jié)果顯示鼻黏膜和鼻息肉組織中黏膜上皮層乙�；旧�(yáng)性,特別是鼻息肉上皮層乙�；黠@增強(qiáng)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果提示HDACs基因在鼻息肉組織中表達(dá)與正常對(duì)照組之間無(wú)明顯差異(P0.05),提示鼻息肉組織中HDACs活性降低與HDACs基因表達(dá)無(wú)直接相關(guān)性。 結(jié)論：鼻息肉組織中HDACs活性降低導(dǎo)致蛋白乙�；鰪�(qiáng),HDACs活性降低與HDAC基因的表達(dá)無(wú)直接相關(guān)性,鼻息肉組織中HAT/HDAC平衡向乙�；鰪�(qiáng)的方向偏移,提示HAT/HDAC活性改變可能參與了鼻息肉的發(fā)生和發(fā)展。 第二部分：病原微生物對(duì)鼻黏膜上皮細(xì)胞乙�；癏DACs基因表達(dá)的影響目的：研究外界病原微生物對(duì)鼻黏膜上皮細(xì)胞乙�；癏DACs基因表達(dá)的影響。方法：取正常鼻黏膜,利用0.01%蛋白酶XIV消化法分離上皮細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng),分別利用細(xì)菌脂多糖(Lipopolysaccharides LPS)和聚肌苷酸胞嘧啶核苷酸Poly (I:C)刺激鼻黏膜上皮細(xì)胞,利用CCK-8檢測(cè)不同濃度的刺激因素對(duì)鼻黏膜上皮細(xì)胞活性的影響。刺激上皮細(xì)胞24h后分別收集細(xì)胞上清和細(xì)胞總RNA,利用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay ELISA)測(cè)定鼻黏膜上皮細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素-6(IL-6)和白細(xì)胞介素-8(IL-8)的水平反映刺激因素對(duì)上皮細(xì)胞的激活作用；通過(guò)細(xì)胞免疫熒光的方法研究LPS和Poly (I:C)的刺激對(duì)鼻黏膜上皮細(xì)胞乙�；挠绊�；提取細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)LPS和poly(I:C)刺激對(duì)鼻黏膜上皮細(xì)胞HDACs基因表達(dá)的影響。結(jié)果：利用0.01%蛋白酶XIV消化分離的方法能夠成功分離培養(yǎng)鼻黏膜上皮細(xì)胞,倒置顯微鏡下觀察見(jiàn)貼壁生長(zhǎng)的鼻黏膜上皮細(xì)胞呈鋪路石樣形態(tài)；細(xì)胞培養(yǎng)約7d后可進(jìn)行傳代培養(yǎng),傳代培養(yǎng)2-3代的上皮細(xì)胞依然保持上皮細(xì)胞的形態(tài)和增殖特性；細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)顯示LPS≥15ug/ml和Poly(I:C)≥25ug/ml會(huì)影響鼻黏膜上皮細(xì)胞的活性。LPS(10ug/ml)和Poly(I:C)(20ug/ml)刺激鼻黏膜上皮細(xì)胞24h后可激活上皮細(xì)胞,表現(xiàn)為上皮細(xì)胞分泌IL-6和IL-8水平顯著升高；細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示LPS和Poly (I:C)刺激均可引起鼻黏膜上皮細(xì)胞乙�；�,刺激所引起的蛋白乙�；粌H局限在細(xì)胞核,細(xì)胞漿內(nèi)亦出現(xiàn)蛋白乙�；�；熒光定量PCR結(jié)果顯示LPS和Poly (I:C)刺激并未引起HDACs基因表達(dá)變化(P0.05)。 結(jié)論：LPS (10ug/ml)和Poly(I:C)(20ug/ml)刺激24h可導(dǎo)致鼻黏膜上皮細(xì)胞蛋白乙�；鰪�(qiáng),引起細(xì)胞核蛋白和細(xì)胞漿蛋白乙�；鰪�(qiáng)。但LPS和Poly (I:C)刺激并未引起HDACs基因表達(dá)的變化。 第三部分：抑制HDACs活性對(duì)鼻黏膜上皮細(xì)胞分泌IL-6. IL-8和LL37的影響 目的：探討抑制HDACs活性對(duì)鼻黏膜上皮細(xì)胞表達(dá)IL-6.IL-8和抗菌肽LL37的影響。 方法：體外培養(yǎng)鼻黏膜上皮細(xì)胞,同時(shí)培養(yǎng)下呼吸道上皮細(xì)胞系NCI-H292細(xì)胞作為平行對(duì)照；利用HDACs抑制劑TSA或SB抑制上皮細(xì)胞HDACs活性,然后利用Poly (I:C)剌激鼻黏膜上皮細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)分六組：TSA單獨(dú)刺激組；SB單獨(dú)刺激組；Poly (I:C)單獨(dú)刺激組；TSA+Poly (I:C)聯(lián)合刺激組；SB+Poly (I:C)聯(lián)合刺激組；上皮細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組。刺激24h后收集細(xì)胞上清、提取細(xì)胞總RNA和細(xì)胞總蛋白,利用ELISA檢測(cè)HDACs抑制劑對(duì)不同組鼻黏膜上皮細(xì)胞表達(dá)IL-6和IL-8水平的影響；利用熒光定量PCR方法檢測(cè)不同刺激因素對(duì)上皮細(xì)胞表達(dá)抗菌肽LL37的影響；通過(guò)western-blot方法分析抑制HDACs活性對(duì)LL37蛋白表達(dá)的影響。 結(jié)果：熒光定量PCR的結(jié)果顯示TSA (200nM)和SB (4mM)能夠誘導(dǎo)LL37基因的表達(dá),并且這種促進(jìn)作用是不依賴于Poly (I:C)的刺激；western-blot的結(jié)果顯示TSA和SB可誘導(dǎo)NCI-H292細(xì)胞LL37蛋白表達(dá)增加,而對(duì)鼻黏膜上皮細(xì)胞LL37蛋白的表達(dá)無(wú)明顯影響；ELISA檢測(cè)顯示TSA或SB作用于上皮細(xì)胞后能夠顯著抑制Poly (I:C)誘導(dǎo)的鼻黏膜上皮細(xì)胞IL-6和IL-8的表達(dá)。 結(jié)論：HDACs抑制劑SB和TSA能夠直接誘導(dǎo)呼吸道上皮細(xì)胞LL37基因的表達(dá),同時(shí)可誘導(dǎo)LL37蛋白在下呼吸道黏膜上皮細(xì)胞的表達(dá)；SB和TSA能夠抑制鼻黏膜上皮細(xì)胞表達(dá)IL-6和IL-8。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R765.25

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 馬慧;李樹(shù)民;;學(xué)習(xí)記憶與表觀遺傳學(xué)[J];中國(guó)老年學(xué)雜志;2013年20期

2 巨少華;代淵;王平;徐世軍;;類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎與表觀遺傳學(xué)[J];中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志;2014年03期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 汪偉;酵母線粒體基因組穩(wěn)定性與組蛋白乙�；芯縖D];浙江大學(xué);2012年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前3條

1 傅瑜;HDAC8調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的機(jī)制研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2013年

2 宣涵;CD9基因影響硼替佐米抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖的研究[D];浙江大學(xué);2014年

3 高進(jìn)良;轉(zhuǎn)錄因子SOX11基因甲基化在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移中的作用[D];廣州醫(yī)科大學(xué);2014年

，

本文編號(hào)：2398621