【摘要】： 聲帶固有層細(xì)胞外基質(zhì)成分是聲帶正常振動(dòng)的基礎(chǔ),其損傷后固有層細(xì)胞外基質(zhì)的組成及分布發(fā)生變化,大量纖維組織增生,形成聲帶瘢痕,導(dǎo)致發(fā)音障礙,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。臨床上,聲帶注射填充術(shù)在一定程度上能改善發(fā)音,但不能恢復(fù)聲帶固有層細(xì)胞外基質(zhì)的組成及分布,也就不能實(shí)現(xiàn)聲帶的結(jié)構(gòu)重建、功能恢復(fù)。近年來,組織工程技術(shù)的發(fā)展給聲帶損傷的修復(fù)重建帶來了希望。種子細(xì)胞和支架材料的選擇是目前研究的核心內(nèi)容,可能對(duì)促進(jìn)聲帶損傷修復(fù)及功能恢復(fù)具有重大意義。應(yīng)用胚胎干細(xì)胞或骨髓干細(xì)胞混合膠原注入受損的聲帶的研究取得了一定的進(jìn)展,但存在倫理限制、細(xì)胞來源少及創(chuàng)傷大等問題,且膠原在聲帶內(nèi)易被吸收。脂肪來源干細(xì)胞(ASCs)體外易分離培養(yǎng),來源豐富,取材簡(jiǎn)便,創(chuàng)傷小。脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(ADM)是天然生物材料,在體內(nèi)可完全降解,對(duì)細(xì)胞和組織無毒性,是良好的細(xì)胞支架材料。 本實(shí)驗(yàn)將兔脂肪來源干細(xì)胞與牛脫細(xì)胞真皮基質(zhì)微粒復(fù)合培養(yǎng)后注入急性損傷的兔聲帶,觀察其對(duì)損傷聲帶的修復(fù)重建效果。 1目的: 探討rASCs-MADM復(fù)合體用于聲帶注射的可行性及其對(duì)聲帶急性損傷的修復(fù)重建效果。 2方法 2.1取兔腹股溝脂肪組織,膠原酶消化,分離培養(yǎng)rASCs,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)規(guī)律,定向誘導(dǎo)培養(yǎng)鑒定細(xì)胞的多向分化潛能,并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行凍存復(fù)蘇培養(yǎng)。 2.2無疫新鮮胎牛皮膚,機(jī)械方法去除表皮及真皮乳頭層,使用網(wǎng)狀層真皮,結(jié)合胰蛋白酶消化法-NaOH消蝕法-凍融法,制成脫細(xì)胞真皮基質(zhì),將其切割成微粒,直徑約200-450μm。取DiI標(biāo)記好的rASCs與制備好的MADM復(fù)合培養(yǎng),熒光顯微鏡、掃描電鏡觀察細(xì)胞黏附材料情況,MTS比色法檢測(cè)rASCs復(fù)合MADM后細(xì)胞增殖情況。復(fù)合體培養(yǎng)3天,與適量膠原混合后注入正常兔聲帶肌內(nèi),術(shù)后2、4、8w內(nèi)窺鏡下觀察聲帶大體形態(tài),并分別隨即取材,冰凍切片后立即在熒光顯微鏡下觀察rASCs在聲帶中存活、分布情況,HE染色觀察聲帶組織對(duì)材料的炎癥排斥反應(yīng)及材料降解情況。 2.3成年雄性新西蘭大白兔6只,體重2.7-3.2kg,隨機(jī)分為2組。麻醉后行喉裂開暴露雙側(cè)聲帶,半導(dǎo)體激光(功率8W)損傷雙側(cè)聲帶膜部后1/2組織,深達(dá)甲杓肌,術(shù)后2、4w內(nèi)窺鏡下觀察兔子雙側(cè)聲帶的大體形態(tài),并隨即分別取材,HE染色觀察聲帶上皮覆蓋損傷部位及固有層組織結(jié)構(gòu)變化情況,Van Gieson染色觀察固有層膠原排列變化。 2.4新西蘭大白兔18只,體重約2.7-3.2kg,隨機(jī)分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組,每組6只。Ⅰ組左聲帶注射rASCs-MADM,Ⅱ組左聲帶注射rASCs,Ⅲ組左聲帶注射MADM,各組右聲帶僅單純損傷,另設(shè)3只兔子的聲帶為正常對(duì)照。聲帶急性損傷,隨即進(jìn)行聲帶注射。聲帶注射術(shù)后2、4、8w內(nèi)窺鏡下觀察聲帶損傷修復(fù)情況,并于術(shù)后8w取材,HE染色觀察聲帶固有層組織結(jié)構(gòu)大體變化,Van Gieson染色法觀察各組聲帶固有層膠原情況。 3結(jié)果 3.1 rASCs體外易分離培養(yǎng),取材料簡(jiǎn)便,增殖能力強(qiáng),在不同微環(huán)境下可分化為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞和成肌細(xì)胞,凍存復(fù)蘇后的細(xì)胞仍能保持良好增殖能力。 3.2 MADM所含膠原連續(xù)性好,相互交織成立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),孔隙約20-50μm,可切割成直徑200-450μm微粒,可行注射方式移植。rASCs能黏附材料上生長(zhǎng)良好并不斷增殖,與常規(guī)培養(yǎng)組細(xì)胞增殖能力比較,有顯著差異。rASCs-MADM在兔聲帶內(nèi)的免疫排斥反應(yīng)輕微,注入8w后,可觀察到有植入細(xì)胞存活和部分材料保留,說明材料生物相容性好,降解速度適當(dāng),是一種良好的支架材料。 3.3喉裂開方式進(jìn)行聲帶損傷來建立聲帶急性損傷模型,損傷部位及程度明確,術(shù)后聲帶無明顯粘連,對(duì)動(dòng)物頸部損傷不大,頸部無局部并發(fā)癥發(fā)生,整個(gè)操作程度簡(jiǎn)單。切片發(fā)現(xiàn):2w聲帶粘膜上皮已覆蓋損傷部位,固有層大量膠原沉積,未形成束狀,4w聲帶損傷部位不平整,固有層膠原沉積增生繼續(xù)增多,呈粗大束狀,排列紊亂。 3.4聲帶急性損傷后即行聲帶注射,并于術(shù)后2、4、8w內(nèi)窺鏡下觀察聲帶大體情況,結(jié)果顯示:注射rASCs-MADM組、rASCs組的聲帶損傷部位光滑,肉芽組織形成少,而注射MADM組聲帶、單純損傷組聲帶損傷部位表面不規(guī)則、肉芽組織形成多。HE染色、Van Gieson染色法顯示,注射rASCs-MADM組、rASCs組聲帶固有層膠原排列連續(xù)有序,而注射MADM組膠原呈彎曲束狀緊密排列,單純損傷組膠原排列紊亂、斷裂,膠原大量沉積增生。 4小結(jié) 4.1 rASCs來源豐富,取材簡(jiǎn)便,體外易分離培養(yǎng),增殖能力強(qiáng),能多向分化,應(yīng)用前景廣。 4.2 MADM制備簡(jiǎn)便,強(qiáng)度適中,具有良好的三維結(jié)構(gòu),生物相容性好,降解速度適當(dāng),是良好的細(xì)胞支架材料和聲帶注射填充材料。 4.3通過喉裂開對(duì)動(dòng)物聲帶損傷來建立聲帶損傷動(dòng)物模型方法可行,對(duì)動(dòng)物損傷不大,操作簡(jiǎn)單。 4.4 rASCs能粘附MADM表面生長(zhǎng),而且MADM能明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖,形成rASCs-MADM復(fù)合體,可行聲帶內(nèi)注射。聲帶注入rASCs-MADM復(fù)合體,不僅對(duì)聲帶有填充增容作用,而且減少聲帶損傷后其固有層的膠原沉積,在一定程度上預(yù)防聲帶萎縮、瘢痕形成,取得比單純注射干細(xì)胞或微粒有更好的修復(fù)效果。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R767

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2393692