【摘要】： 目的:糖尿病(diabetes mellitus, DM)是一種常見的代謝性疾病,已嚴重的危害到人類健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報告,我國的糖尿病人數(shù)居世界第二,在未來的十年內(nèi),由糖尿病帶來的經(jīng)濟損失,中國居世界首位。糖尿病高致殘和高死亡的主要原因是糖尿病慢性并發(fā)癥,而在眼部主要表現(xiàn)為低視力和高致盲率。糖尿病性白內(nèi)障(diabetic cataract, DC)是最重要的致盲因素。由于DC的機制尚不清楚,因此,DC機制的研究對降低致盲率和提高患者的生活質(zhì)量有重要的意義。 目前,氧化應(yīng)激(oxidative stress)被公認為是DC發(fā)病機制的中心環(huán)節(jié)。氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵酶是誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS),已證實核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)是調(diào)控iNOS轉(zhuǎn)錄最重要的反式作用因子,能增強iNOS的轉(zhuǎn)錄活性,產(chǎn)生過量的一氧化氮(nitric oxide,NO)和超氧陰離子(superoxide anion,O2-.)。NO與O2-.快速反應(yīng),生成氧化能力較H2O2大2000倍的過氧亞硝基陰離子(peroxynitrite, ONOO-),造成氧化損傷。本小組前期研究表明,ONOO-參與介導(dǎo)DC的發(fā)生與發(fā)展。ONOO-可引起蛋白質(zhì)中酪氨酸殘基硝基化,硝基化后的蛋白質(zhì)其結(jié)構(gòu)和功能會發(fā)生改變,而硝基酪氨酸(nitrotyrosine, NT)則是蛋白質(zhì)硝基化的一個特異性檢測標志。 NF-κB家族包括p50, p52, p65 (RelA), c-Rel和RelB五個成員。它們中只有p65、c-Rel和RelB含有轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域,可與共激活因子結(jié)合,激活基因轉(zhuǎn)錄。NF-κB普遍以p50/ p65異二聚體的形式存在于細胞漿中,激活后NF-κB轉(zhuǎn)位入核,結(jié)合順式作用元件,p65通過招募共激活因子p300共同調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。p300在不同組織含量不同,其蛋白含量的改變可調(diào)節(jié)與轉(zhuǎn)錄因子的相互作用,對調(diào)控基因表達有重要影響。因此,p300對NF-κB p65的激活活性有重要作用。研究表明,在血管內(nèi)皮細胞中,高糖刺激增強p300與NF-κB p65的相互作用,使NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性增強。在糖尿病大鼠腎臟中,p300的mRNA及蛋白表達均升高,并增強NF-κBp65的轉(zhuǎn)錄活性。而在眼部的晶狀體中,晶狀體上皮細胞是代謝、合成、轉(zhuǎn)運過程的中心,也是最先受損傷的靶細胞。在DC的發(fā)病過程中,晶狀體上皮細胞中的p300與NF-κB是否起著關(guān)鍵作用呢?已有報道,高糖致白內(nèi)障大鼠晶狀體內(nèi)NF-κB蛋白表達量增高。而在DC中對p300蛋白作用的研究未見報道。那么,在高糖刺激的人晶狀體上皮細胞(SRA01/04)中,細胞核內(nèi)p300蛋白含量如何?是否能引起p300與NF-κB的硝基化?硝基化后對p300與NF-κB結(jié)合活性的影響如何?是本研究擬解決的核心問題。 本實驗用高糖、SIN-1(ONOO-供體)、FeTPPS(ONOO-的分解催化劑)等因素作用于SRA01/04細胞,以觀察細胞核中p300蛋白含量、p300與NF-κB的硝基化水平、及硝基化對二者結(jié)合活性的影響,探討高糖致人晶狀體上皮細胞損傷的機制,為防治DC提供新思路。 方法: 1細胞培養(yǎng)及收集。 SRA01/04細胞株用含10%胎牛血清、1%非必須氨基酸、低糖DMEM培養(yǎng)基,置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞傳代后,將細胞種至培養(yǎng)皿內(nèi),至細胞覆蓋皿底90%,加不同因素作用后,刮取,收集于EP管中,用以提取核蛋白。將細胞種于覆蓋玻片的六孔板內(nèi),制細胞爬片,各因素作用后,多聚甲醛固定,用以檢測細胞共定位及核轉(zhuǎn)位。 2分組及檢測指標。 2.1根據(jù)不同的因素和作用時間分為4組,以確定最佳濃度及時間。(1)不同濃度葡萄糖組(5,10,15,20,25,30mmol/L) (2)同濃度葡萄糖不同作用時間組(0,5,10,15,20,25,30,35,40min) (3)不同濃度SIN-1組(0,10,50,100,250,500μmol/L) (4)高糖+不同濃度FeTPPS組(0,5,10,25,50,100μmol/L) 2.1.1 SRA01/04細胞分別經(jīng)2.1作用因素作用后,細胞核蛋白用Lowry法檢測蛋白含量,Western-blotting檢測p300的蛋白含量及硝基化水平(NT含量);NF-κB p65不同糖濃度及作用時間的蛋白含量。 2.1.2制作SRA01/04細胞爬片后,分別經(jīng)2.1作用因素作用,用熒光顯微鏡檢測NF-κB p65的核轉(zhuǎn)位。 2.2以作用因素最佳濃度及時間進行以下實驗。(1)正常對照組(2)高糖組(25 mmol/L,25min) (3) SIN-1組(500μmol/L,25min) (4)高糖+ FeTPPS組(25 mmol/L+50μmol/L,25min) 2.2.1 SRA01/04細胞經(jīng)2.2作用因素作用后,用Lowry法定量核蛋白,檢測p300與NF-κB p65的相互作用。 2.2.2 Western-blotting檢測免疫共沉淀的p300和NF-κB p65蛋白含量、硝基化水平(NT含量)及硝基化對p300與NF-κB p65相互作用的影響。 2.2.3激光共聚焦顯微鏡檢測p300與NF-κB p65的共定位。 結(jié)果: 1 SRA01/04細胞核蛋白中p300蛋白含量的Western blotting檢測結(jié)果。 1.1不同濃度葡萄糖組(5,10,15,20,25,30mmol/L)與正常糖濃度5 mmol/L比較,10mmol/L(P0.05),15mmol/L(P0.05),20mmol/L(P0.01),25mmol/L(P0.01),30mmol/L(P0.01)各組p300蛋白含量均增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果顯示:隨著葡萄糖濃度的升高,p300蛋白含量也隨之升高,25mmol/L時升高最明顯,30mmol/L時下降。 1.2 25mmol/L葡萄糖不同作用時間組(0,5,10,15,20,25,30,35,40min) 與25mmol/L糖濃度作用0min比較,5min(P0.05),10min(P0.05),15min(P0.01),20min(P0.01),25min(P0.01),30min(P0.01),35min(P0.01),40min(P0.01)各組p300蛋白含量均增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果顯示:隨著時間的延長,p300蛋白含量隨之增高,25min時升高最明顯,30min時下降。 1.3不同濃度SIN-1組(0,10,50,100,250,500μmol/L)與SIN-1濃度為0μmol/L即正常糖濃度5 mmol/L比較,SIN-1濃度10μmol/L(P0.05),50μmol/L(P0.01),100μmol/L(P0.01),250μmol/L(P0.01),500μmol/L(P0.01)各組p300蛋白含量均增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果顯示:隨SIN-1濃度的增加,p300蛋白含量隨之升高,在500μmol/L時升高最明顯。1.4 25mmol/L葡萄糖+不同濃度FeTPPS組(0,5,10,25,50,100μmol/L)與FeTPPS濃度為0μmol/L即25 mmol/L的糖濃度比較,FeTPPS濃度5μmol/L(P0.05),10μmol/L(P0.05),25μmol/L(P0.05),50μmol/L(P0.01),100μmol/L(P0.01)各組p300蛋白含量均降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果顯示:FeTPPS濃度在5-25μmol/L時, p300蛋白含量降低。在50-100μmol/L時,p300蛋白含量降低明顯。 2 SRA01/04細胞核蛋白中p300硝基化水平變化的Western blotting檢測結(jié)果。 2.1不同濃度葡萄糖組作用25min(5,10,15,20,25,30mmol/L)與正常糖濃度5 mmol/L比較,10mmol/L(P0.05),15mmol/L(P0.05),20mmol/L(P0.01),25mmol/L(P0.01),30mmol/L(P0.01)除10mmol/L外,各組p300蛋白硝基化水平均增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果顯示:隨著葡萄糖濃度的升高,p300蛋白硝基化水平也隨之升高,25mmol/L時升高最明顯,30mmol/L時下降。 2.2不同濃度SIN-1組(0,10,50,100,250,500μmol/L)與SIN-1濃度為0μmol/L即正常糖濃度5 mmol/L比較,SIN-1濃度10μmol/L(P0.05),50μmol/L(P0.01),100μmol/L(P0.01),250μmol/L(P0.01),500μmol/L(P0.01)各組p300蛋白硝基化水平均增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果顯示:隨著SIN-1濃度的升高,p300蛋白硝基化水平也隨之升高,500μmol/L時升高最明顯。 2.3 25mmol/L葡萄糖+不同濃度FeTPPS組(0,5,10,25,50,100μmol/L)與FeTPPS濃度為0μmol/L即25 mmol/L的糖濃度比較,FeTPPS濃度5μmol/L(P0.05),10μmol/L(P0.01),25μmol/L(P0.01),50μmol/L(P0.01),100μmol/L(P0.01)各組p300蛋白硝基化水平均降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果顯示:隨著FeTPPS濃度的升高,p300蛋白硝基化水平隨之降低,50-100μmol/L時,p300蛋白硝基化水平降低明顯。 3 SRA01/04細胞核蛋白中NF-κB p65蛋白含量的Western blotting檢測結(jié)果。 3.1不同濃度葡萄糖組(5,10,15,20,25,30mmol/L)與正常糖濃度5 mmol/L比較,10mmol/L(P0.05),15mmol/L(P0.01),20mmol/L(P0.01),25mmol/L(P0.01),30mmol/L(P0.01)各組NF-κB p65蛋白含量均增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果顯示:隨著葡萄糖濃度的升高,p65蛋白含量也隨之升高, 25mmol/L時升高最明顯,30mmol/L時下降。 3.2 25mmol/L葡萄糖不同作用時間(0,5,10,15,20,25,30,35,40min)與25mmol/L糖濃度作用0min比較,5min(P0.05),10min(P0.01),15min(P0.01),20min(P0.01),25min(P0.01),30min(P0.01),35min(P0.01),40min(P0.01)各組NF-κB p65蛋白含量均增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果顯示:隨著時間的延長,p65蛋白含量隨之增高,20min時升高最明顯,25min時下降。 4 SRA01/04細胞中NF-κB p65的核轉(zhuǎn)位。 4.1 25mmol/L葡萄糖不同作用時間組(0,5,10,15,20,25,30,35,40min) 與25mmol/L糖濃度作用0min比較,5min(P0.05),10min(P0.05),15min(P0.01),20min(P0.01),25min(P0.01),30min(P0.01),35min(P0.01),40min(P0.01)除了作用5min外,各組p65核轉(zhuǎn)位比率均增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果顯示:隨著時間的延長,p65核轉(zhuǎn)位也隨之增多,25-30min時升高最明顯,35min時下降。 4.2不同濃度SIN-1組(0,50,500μmol/L,25min)與未加SIN-1的5mmol/L正常糖濃度組比較,50μmol/L(P0.01),500μmol/L(P0.01)各組p65核轉(zhuǎn)位比率均增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果顯示:隨著SIN-1作用濃度的增加,p65核轉(zhuǎn)位比率也隨之增加。 4.3 25mmol/L葡萄糖+不同濃度FeTPPS組(0,10,50μmol/L,25min)與未加FeTPPS的25mmol/L葡萄糖組比較,10μmol/L(P0.01),50μmol/L(P0.01)各組p65核轉(zhuǎn)位比率均降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果顯示:隨著FeTPPS作用濃度的增加,p65核轉(zhuǎn)位比率也隨之下降。 5 SRA01/04細胞核蛋白中,p300與NF-κB p65的相互作用及硝基化水平。由核蛋白中p300蛋白含量及硝基化水平可確定各因素最佳作用濃度及作用時間。(1)正常組(5 mmol/L,25min) (2)高糖組(25 mmol/L,25min) (3)SIN-1組(500μmol/L,25min)(4)高糖+ FeTPPS組(25 mmol/L+50μmol/L,25min) 5.1核蛋白中p300、NF-κB p65蛋白含量 p300蛋白含量結(jié)果顯示,與正常組相比,高糖組(P0.01),SIN-1組(P0.01)p300蛋白含量均增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;高糖+ FeTPPS組(P0.05)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與高糖組相比,SIN-1組(P0.05)差異無統(tǒng)計學(xué)意義,高糖+ FeTPPS組(P0.01)p300蛋白含量降低。與SIN-1組相比,高糖+ FeTPPS組(P0.01)p300蛋白含量降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。p65蛋白含量結(jié)果顯示,與正常組相比,高糖組(P0.01),SIN-1組(P0.01)p65蛋白含量均增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;高糖+ FeTPPS組(P0.05)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與高糖組相比,SIN-1組(P0.05)差異無統(tǒng)計學(xué)意義,高糖+ FeTPPS組(P0.01)p65蛋白含量降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。與SIN-1組相比,高糖+ FeTPPS組(P0.01)p65蛋白含量降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。表明高糖組、SIN-1組中p300與NF-κB p65蛋白含量均明顯增加,高糖+ FeTPPS組中p300與NF-κB p65蛋白含量較高糖組和SIN-1組明顯降低。 5.2核蛋白中p300、NF-κB p65蛋白硝基化水平 p300蛋白硝基化水平結(jié)果顯示,與正常組相比,高糖組(P0.01),SIN-1組(P0.01)p300蛋白硝基化水平均增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;高糖+ FeTPPS組(P0.05)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與高糖組相比,SIN-1組(P0.05)差異無統(tǒng)計學(xué)意義,高糖+ FeTPPS組(P0.01)p300蛋白硝基化水平降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。與SIN-1組相比,高糖+ FeTPPS組(P0.01)p300蛋白硝基化水平降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。p65蛋白硝基化水平結(jié)果顯示,與正常組相比,高糖組(P0.01),SIN-1組(P0.01)p65蛋白硝基化水平均增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;高糖+ FeTPPS組(P0.05)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與高糖組相比,SIN-1組(P0.05)差異無統(tǒng)計學(xué)意義,高糖+ FeTPPS組(P0.01)p65蛋白硝基化水平降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。與SIN-1組相比,高糖+ FeTPPS組(P0.01)p65蛋白硝基化水平降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。表明高糖組、SIN-1組中p300與NF-κB p65蛋白硝基化水平均明顯增加,高糖+ FeTPPS組中p300與NF-κB p65蛋白硝基化水平較高糖組和SIN-1組明顯降低。 5.3硝基化對p300與NF-κB p65相互作用的影響。與p300蛋白相互作用的p65蛋白含量及硝基化水平結(jié)果顯示,與正常組相比,高糖組(P0.01),SIN-1組(P0.01)p65蛋白含量及硝基化水平均增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;高糖+ FeTPPS組(P0.05)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與高糖組相比,SIN-1組(P0.05)差異無統(tǒng)計學(xué)意義,高糖+ FeTPPS組(P0.01)p65蛋白含量及硝基化水平均降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。與SIN-1組相比,高糖+ FeTPPS組(P0.01)p65蛋白含量及硝基化水平均降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。與p65蛋白相互作用的p300蛋白含量及硝基化水平結(jié)果顯示,與正常組相比,高糖組(P0.01),SIN-1組(P0.01)p300蛋白含量及硝基化水平均增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;高糖+ FeTPPS組(P0.05)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與高糖組相比,SIN-1組(P0.05)差異無統(tǒng)計學(xué)意義,高糖+ FeTPPS組(P0.01)p300蛋白含量及硝基化水平均降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。與SIN-1組相比,高糖+ FeTPPS組(P0.01)p300蛋白含量及硝基化水平均降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。表明高糖組、SIN-1組中p300與NF-κB p65蛋白相互作用及硝基化水平均明顯增加,高糖+ FeTPPS組中p300與NF-κB p65蛋白相互作用及硝基化水平較高糖組和SIN-1組明顯降低。 6 SRA01/04細胞中p300與NF-κB p65蛋白的共定位 p300與NF-κB p65蛋白共定位的細胞數(shù)量,與5mmol/L正常糖濃度組比較,高糖組(P0.01),SIN-1組(P0.01)p300與NF-κB p65蛋白共定位的細胞數(shù)量增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;高糖+ FeTPPS組(P0.05)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與高糖組相比,SIN-1組(P0.05)差異無統(tǒng)計學(xué)意義,高糖+ FeTPPS組(P0.01)p300與NF-κB p65蛋白共定位的細胞數(shù)量降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。與SIN-1組相比,高糖+ FeTPPS組(P0.01)p300與NF-κB p65蛋白共定位的細胞數(shù)量降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。表明高糖組、SIN-1組中p300與NF-κB p65蛋白共定位的細胞數(shù)量均明顯增加,高糖+ FeTPPS組中p300與NF-κB p65蛋白共定位的細胞數(shù)量較高糖組和SIN-1組明顯降低。 結(jié)論: 1高糖刺激人晶狀體上皮細胞(SRA01/04),p300在核內(nèi)聚集,含量增加。 2高糖刺激人晶狀體上皮細胞(SRA01/04),可使p300和NF-κB蛋白硝基化。 3硝基化可增強p300與NF-κB的相互作用,抑制p300與NF-κB的硝基化可在防治DC中起關(guān)鍵作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R587.2;R771.3

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前6條

1 郝麗娜;凌毅群;羅秀梅;毛宇湘;毛綺妍;何守志;凌亦凌;;葛根素減輕部分由過氧亞硝基陰離子導(dǎo)致的糖尿病大鼠晶狀體上皮細胞凋亡(英文)[J];生理學(xué)報;2006年06期

2 Michalis V Karamouzis;Panagiotis A Konstantinopoulos;Athanasios G Papavassiliou;;Roles of CREB-binding protein (CBP)/p300 in respiratory epithelium tumorigenesis[J];Cell Research;2007年04期

3 劉偉;林漢生;;SPSS在完全隨機設(shè)計多個樣本間多重比較Nemenyi秩和檢驗中的應(yīng)用[J];中國衛(wèi)生統(tǒng)計;2009年02期

4 鞏秋紅;李光偉;;2005北京國際糖尿病預(yù)防高層論壇紀要[J];中華內(nèi)分泌代謝雜志;2006年01期

5 李光偉;;糖尿病一級預(yù)防任重道遠[J];中華內(nèi)科雜志;2006年02期

6 ;The antagonism of cholecystokinin octapeptide-8 to the peroxynitrite oxidation on a diabetic cataractal rat model[J];Chinese Medical Journal;2006年17期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 譚小玲;p300及其結(jié)合功能在缺氧神經(jīng)細胞損傷中的作用[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2005年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 栗彥寧;糖尿病血管病變中iNOS和COX-2的硝基化對其相互作用的影響及中藥防治[D];河北醫(yī)科大學(xué);2008年

，

本文編號：2386035