發(fā)布時間：2018-12-14 14:51

【摘要】： 鼻咽癌是以高轉(zhuǎn)移性為突出特點的惡性腫瘤,大部分患者由于早期發(fā)生轉(zhuǎn)移而預后不良。EB病毒(Epstein-Barr Virus, EBV)編碼的主要致瘤蛋白即潛伏膜蛋白1 (latent membrane protein, LMP1)與鼻咽癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。 趨化因子影響腫瘤細胞的黏附、侵襲和轉(zhuǎn)移,趨化因子及其受體參與腫瘤轉(zhuǎn)移的機制尚未完全闡明。趨化因子SDF-1 (CXCL12)受體CXCR4表達和活化可促進腫瘤細胞向高表達SDF-1的部位(如骨和淋巴結(jié))轉(zhuǎn)移,與多種腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移相關(guān)。 最近幾年,酪氨酸的硫酸化(tyrosine sulfation)作為一種重要的翻譯后修飾(post-translational modification, PTM)的方式,因其對趨化因子受體活性調(diào)節(jié)而受到重視。酪氨酸的硫酸化的主要作用是促進分泌型蛋白的分泌或膜蛋白與其它蛋白特別是配體之間的相互作用。趨化因子受體CXCR4第21位的酪氨酸是其主要的硫酸化位點。體內(nèi)負責催化酪氨酸硫酸化的酶為酪氨酰蛋白硫酸轉(zhuǎn)移酶(tyrosylprotein sulfotransferase, TPST),編碼該酶兩種亞基的基因即TPST-1和TPST-2,都具有高度保守的硫酸轉(zhuǎn)移酶區(qū)域,定位于高爾基體中的TPST-1可對酪氨酸進行硫酸化,參與酪氨酸的硫酸化循環(huán)。 我們前期工作發(fā)現(xiàn),LMP1在鼻咽癌細胞中通過NF-κB信號通路上調(diào)EGFR的表達并使其發(fā)生磷酸化；作為一個新型的轉(zhuǎn)錄因子,磷酸化的EGFR轉(zhuǎn)位入核可反式活化與細胞增殖有關(guān)的基因如cyclinD1和cyclinE。同時,我們通過生物信息學發(fā)現(xiàn)TPST-1基因(GenBank AF038009)5'UTR內(nèi)存在一個可能的EGFR結(jié)合位點,即TGTTT(位于-28—-24位之間)。這一發(fā)現(xiàn)使我們有理由推測EGFR可能通過該酶催化CXCR4硫酸化從而影響其與配體的結(jié)合。因此,我們提出LMP1可能通過EGFR調(diào)節(jié)CXCR4的活性促進鼻咽癌細胞的轉(zhuǎn)移。 1. CXCR4硫酸化促進鼻咽癌細胞的轉(zhuǎn)移 酪氨酸的硫酸化作為一種重要的翻譯后修飾的方式,其在趨化因子受體活性調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的作用。利用高轉(zhuǎn)移的5-8F和不轉(zhuǎn)移的6-10B鼻咽癌細胞為基本模型,研究發(fā)現(xiàn)高轉(zhuǎn)移的5-8F細胞呈高硫酸化狀態(tài)。提示,硫酸化可能與細胞的轉(zhuǎn)移能力有關(guān)。 進一步利用硫酸化特異性抑制劑氯酸鈉(sodium chlorate)抑制高轉(zhuǎn)移的5-8F細胞蛋白硫酸化活性,通過趨化實驗(chemotaxis)和Matrigel侵襲實驗發(fā)現(xiàn)抑制5-8F細胞硫酸化可以抑制細胞的趨化活性和侵襲轉(zhuǎn)移能力。同時利用不轉(zhuǎn)移鼻咽癌6-10B細胞,轉(zhuǎn)染野生型WT-CXCR4和突變型MUT-CXCR4表達質(zhì)粒后,進行趨化實驗和Matrigel侵襲實驗,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-CXCR4表達質(zhì)粒后細胞的趨化活性和侵襲轉(zhuǎn)移能力明顯增強,而轉(zhuǎn)染MUT-CXCR4表達質(zhì)粒后并沒影響細胞的趨化活性和侵襲轉(zhuǎn)移能力。這些結(jié)果提示,細胞蛋白的硫酸化,特別是CXCR4的硫酸化與細胞的轉(zhuǎn)移相關(guān),而CXCR4第21位酪氨酸硫酸化在促進鼻咽癌細胞轉(zhuǎn)移的過程中起到非常重要的作用。 我們檢測高轉(zhuǎn)移5-8F細胞和不轉(zhuǎn)移6-10B細胞的TPST-1的表達發(fā)現(xiàn),高轉(zhuǎn)移5-8F細胞TPST-1的mRNA水平和蛋白水平均高于6-10B細胞。進一步抑制5-8F的TPST-1可以抑制其CXCR4的硫酸化水平,而在6-10B細胞中轉(zhuǎn)染TPST-1表達質(zhì)�？梢陨险{(diào)CXCR4的硫酸化水平。近年來,在人們發(fā)現(xiàn)細胞表面的膜受體EGFR和FGFR能夠移位入核之后,新近有研究發(fā)現(xiàn)細胞膜表面受體CXCR4同樣能夠入核。我們首先檢測高轉(zhuǎn)移和不轉(zhuǎn)移的5-8F細胞和6-10B細胞的CXCR4是否存在核定位,采用亞細胞組分結(jié)合Western Blot及激光共聚焦技術(shù),從定性和定量水平均發(fā)現(xiàn)5-8F細胞核內(nèi)存在CXCR4蛋白的表達。進一步利用特異性硫酸化抑制劑和TPST-1 siRNA處理5-8F細胞后,SDF-1α30nm刺激細胞30min,發(fā)現(xiàn)其細胞核內(nèi)的CXCR4蛋白明顯減少。提示,CXCR4的核移位與CXCR4的硫酸化密切相關(guān)。 2.EB病毒LMP1通過調(diào)節(jié)CXCR4功能活性促進鼻咽癌細胞轉(zhuǎn)移 上一個部分我們在5-8F和6-10B細胞中研究發(fā)現(xiàn)CXCR4的硫酸化與鼻咽癌細胞的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。我們實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)LMP1在高轉(zhuǎn)移5-8F細胞的表達高于不轉(zhuǎn)移6-10B細胞,結(jié)合LMP1在鼻咽癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用,提示我們：在鼻咽癌細胞中,LMP1可能是通過對CXCR4硫酸化的調(diào)控,進而影響鼻咽癌的轉(zhuǎn)移。 首先應用流式細胞術(shù)進一步確證高硫酸化的5-8F細胞高表達LMP1后,采用可調(diào)控LMP1表達的細胞系,本研究發(fā)現(xiàn)在鼻咽癌細胞系中LMP1可誘導CXCR4的表達,并呈劑量誘導效應。進一步采用免疫共沉淀將CXCR4沉淀分離后,Western Blot檢測酪氨酸硫酸化水平即CXCR4硫酸化變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨DOX劑量的增加,CXCR4的硫酸化也隨之增加。提示,LMP1能夠上調(diào)CXCR4的硫酸化。同樣我們應用Tet-on LMP1 HNE2細胞,用不同DOX劑量誘導24h后,在不同濃度的SDF-1α的作用下,進行趨化實驗,結(jié)果發(fā)現(xiàn)LMP1能夠上調(diào)CXCR4的趨化活性,說明LMP1通過上調(diào)CXCR4硫酸化進而影響其功能活性。 業(yè)已證實LMP1調(diào)控CXCR4的硫酸化及其功能活性,那么我們將探討LMP1是否誘導CXCR4核移位。采用亞細胞組分結(jié)合Western Blot及激光共聚焦技術(shù),我們從定性和定量水平均發(fā)現(xiàn)Tet-on LMP1HNE2細胞核內(nèi)部分存在CXCR4的蛋白表達,且隨LMP1表達的增加而增加。進一步我們在Tet-on LMP1 HNE2細胞中轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-CXCR4和MUT-CXCR4表達質(zhì)粒24h后,分別在DOX (0,6ug/ml)劑量誘導下,采用亞細胞組分結(jié)合激光共聚焦技術(shù),我們從定性水平發(fā)現(xiàn)LMP1促進了WT-CXCR4組細胞CXCR4蛋白的核積聚。這些結(jié)果表明LMP1通過調(diào)控CXCR4的硫酸化進而影響CXCR4的核移位。 最后利用HNE2-PSG5和HNE2-LMP1細胞,分別轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-CXCR4和MUT-CXCR4表達質(zhì)粒24h后,Matrigel侵襲實驗發(fā)現(xiàn)LMP1促進轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-CXCR4質(zhì)粒組細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力,并沒有影響MUT-CXCR4質(zhì)粒組細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力。進一步說明LMP1通過誘導CXCR4第21位酪氨酸硫酸化功能活性進而促進鼻咽癌細胞的轉(zhuǎn)移。 3.EB病毒LMP1通過EGFR介導CXCR4硫酸化 我們的前期工作證實LMP1上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子EGFR的表達,而且我們通過基因信息學發(fā)現(xiàn)酪氨酰蛋白硫酸轉(zhuǎn)移酶TPST-1的啟動子區(qū)存在EGFR的結(jié)合位點。因此我們推測LMP1有可能是通過EGFR介導TPST-1上調(diào)CXCR4的硫酸化。 采用鼻咽癌Tet-on LMP1 HNE2細胞,應用Real-time-PCR和Western Blot技術(shù)發(fā)現(xiàn)LMP1上調(diào)TPST-1的mRNA和蛋白水平,EGFR siRNA處理Tet-on LMP1 HNE2細胞24h阻斷EGFR表達后,TPST-1表達下調(diào),初步說明LMP1誘導的TPST-1是EGFR所依賴的。 采用ChIP發(fā)現(xiàn),LMP1可以促進EGFR與TPST-1的結(jié)合,采用報告基因分析發(fā)現(xiàn),LMP1增加TPST-1啟動子活性,而突變EGFR與TPST-1的結(jié)合位點,我們發(fā)現(xiàn)LMP1增加的TPST-1啟動子活性顯著下調(diào)。進一步說明LMP1誘導的TPST-1和CXCR4的硫酸化是EGFR所依賴的。 小結(jié)：我們以鼻咽癌細胞系為基本實驗模型,從比較具有不同轉(zhuǎn)移潛能的鼻咽癌細胞系之間CXCR4硫酸化狀態(tài)的差異入手,進行LMP1對CXCR4硫酸化及亞細胞定位和功能的研究,本研究主要采用阻斷策略結(jié)合Western Blotting、趨化實驗、侵襲實驗、ChIP、體外定點突變等分子生物學實驗方法,從蛋白硫酸化修飾的角度來闡明LMP1調(diào)節(jié)CXCR4的分子機制,取得如下重要的創(chuàng)新性發(fā)現(xiàn)： 1.首次發(fā)現(xiàn)CXCR4的硫酸化可以促進鼻咽癌細胞的轉(zhuǎn)移。抑制高轉(zhuǎn)移5-8F細胞的硫酸化可以抑制其CXCR4的趨化活性和細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力,且轉(zhuǎn)染野生型的CXCR4表達質(zhì)�？梢源龠M不轉(zhuǎn)移的6-10B細胞CXCR4的趨化活性和細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力。高轉(zhuǎn)移鼻咽癌細胞高表達硫酸化轉(zhuǎn)移酶TPST-1,且TPST-1siRNA可以有效的阻斷CXCR4的硫酸化。首次發(fā)現(xiàn)鼻咽癌5-8F細胞核內(nèi)存在CXCR4蛋白的表達。利用特異性硫酸化抑制劑和TPST-1siRNA抑制CXCR4的硫酸化可有效阻斷5-8F細胞CXCR4蛋白核移位。 2.首次發(fā)現(xiàn)EB病毒LMP1上調(diào)CXCR4的硫酸化水平、功能活性和促進CXCR4蛋白的核移位,并呈一定劑量效應。且發(fā)現(xiàn)LMP1調(diào)控CXCR4核移位是通過其上調(diào)CXCR4的硫酸化實現(xiàn)的。同時發(fā)現(xiàn)LMP1上調(diào)CXCR4的硫酸化與鼻咽癌細胞轉(zhuǎn)移相關(guān)。 3.首次發(fā)現(xiàn)LMP1可以上調(diào)TPST-1的mRNA和蛋白表達水平,并呈劑量依賴效應。EGFR siRNA可以抑制LMP1上調(diào)的TPST-1表達。在LMP1調(diào)控下,轉(zhuǎn)錄因子EGFR與TPST-1的啟動子結(jié)合增強。并發(fā)現(xiàn)LMP1增加TPST-1啟動子活性,突變EGFR在TPST-1啟動子上的結(jié)合位點可以下調(diào)LMP1調(diào)控的TPST-1的啟動子活性。 本論文以EBV的致瘤蛋白LMP1通過轉(zhuǎn)錄因子EGFR對酪氨酸硫酸化轉(zhuǎn)移酶TPST-1的調(diào)控為切入點,從CXCR4硫酸化翻譯后修飾的角度來闡明LMP1-EGFR-TPST-1-CXCR4信號轉(zhuǎn)導通路在鼻咽癌轉(zhuǎn)移中的分子機制及其生物學意義。通過本研究,將EB病毒與趨化因子及其受體通過信號轉(zhuǎn)導聯(lián)系起來,提出了新的工作模式。為EB病毒致瘤分子機理研究開拓一個新的視野,為靶向LMP1和CXCR4抗信號轉(zhuǎn)導治療腫瘤提供了新的實驗依據(jù),這將有助于從分子水平揭示鼻咽癌轉(zhuǎn)移發(fā)生機制,為鼻咽癌的防治提供新的理論依據(jù)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R739.63

【參考文獻】

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本文編號：2378785