【摘要】： 鼻咽癌是以高轉(zhuǎn)移性為突出特點(diǎn)的惡性腫瘤,大部分患者由于早期發(fā)生轉(zhuǎn)移而預(yù)后不良。EB病毒(Epstein-Barr Virus, EBV)編碼的主要致瘤蛋白即潛伏膜蛋白1 (latent membrane protein, LMP1)與鼻咽癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。 趨化因子影響腫瘤細(xì)胞的黏附、侵襲和轉(zhuǎn)移,趨化因子及其受體參與腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚未完全闡明。趨化因子SDF-1 (CXCL12)受體CXCR4表達(dá)和活化可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞向高表達(dá)SDF-1的部位(如骨和淋巴結(jié))轉(zhuǎn)移,與多種腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移相關(guān)。 最近幾年,酪氨酸的硫酸化(tyrosine sulfation)作為一種重要的翻譯后修飾(post-translational modification, PTM)的方式,因其對(duì)趨化因子受體活性調(diào)節(jié)而受到重視。酪氨酸的硫酸化的主要作用是促進(jìn)分泌型蛋白的分泌或膜蛋白與其它蛋白特別是配體之間的相互作用。趨化因子受體CXCR4第21位的酪氨酸是其主要的硫酸化位點(diǎn)。體內(nèi)負(fù)責(zé)催化酪氨酸硫酸化的酶為酪氨酰蛋白硫酸轉(zhuǎn)移酶(tyrosylprotein sulfotransferase, TPST),編碼該酶兩種亞基的基因即TPST-1和TPST-2,都具有高度保守的硫酸轉(zhuǎn)移酶區(qū)域,定位于高爾基體中的TPST-1可對(duì)酪氨酸進(jìn)行硫酸化,參與酪氨酸的硫酸化循環(huán)。 我們前期工作發(fā)現(xiàn),LMP1在鼻咽癌細(xì)胞中通過NF-κB信號(hào)通路上調(diào)EGFR的表達(dá)并使其發(fā)生磷酸化；作為一個(gè)新型的轉(zhuǎn)錄因子,磷酸化的EGFR轉(zhuǎn)位入核可反式活化與細(xì)胞增殖有關(guān)的基因如cyclinD1和cyclinE。同時(shí),我們通過生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)TPST-1基因(GenBank AF038009)5'UTR內(nèi)存在一個(gè)可能的EGFR結(jié)合位點(diǎn),即TGTTT(位于-28—-24位之間)。這一發(fā)現(xiàn)使我們有理由推測(cè)EGFR可能通過該酶催化CXCR4硫酸化從而影響其與配體的結(jié)合。因此,我們提出LMP1可能通過EGFR調(diào)節(jié)CXCR4的活性促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。 1. CXCR4硫酸化促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移 酪氨酸的硫酸化作為一種重要的翻譯后修飾的方式,其在趨化因子受體活性調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的作用。利用高轉(zhuǎn)移的5-8F和不轉(zhuǎn)移的6-10B鼻咽癌細(xì)胞為基本模型,研究發(fā)現(xiàn)高轉(zhuǎn)移的5-8F細(xì)胞呈高硫酸化狀態(tài)。提示,硫酸化可能與細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力有關(guān)。 進(jìn)一步利用硫酸化特異性抑制劑氯酸鈉(sodium chlorate)抑制高轉(zhuǎn)移的5-8F細(xì)胞蛋白硫酸化活性,通過趨化實(shí)驗(yàn)(chemotaxis)和Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)抑制5-8F細(xì)胞硫酸化可以抑制細(xì)胞的趨化活性和侵襲轉(zhuǎn)移能力。同時(shí)利用不轉(zhuǎn)移鼻咽癌6-10B細(xì)胞,轉(zhuǎn)染野生型WT-CXCR4和突變型MUT-CXCR4表達(dá)質(zhì)粒后,進(jìn)行趨化實(shí)驗(yàn)和Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-CXCR4表達(dá)質(zhì)粒后細(xì)胞的趨化活性和侵襲轉(zhuǎn)移能力明顯增強(qiáng),而轉(zhuǎn)染MUT-CXCR4表達(dá)質(zhì)粒后并沒影響細(xì)胞的趨化活性和侵襲轉(zhuǎn)移能力。這些結(jié)果提示,細(xì)胞蛋白的硫酸化,特別是CXCR4的硫酸化與細(xì)胞的轉(zhuǎn)移相關(guān),而CXCR4第21位酪氨酸硫酸化在促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的過程中起到非常重要的作用。 我們檢測(cè)高轉(zhuǎn)移5-8F細(xì)胞和不轉(zhuǎn)移6-10B細(xì)胞的TPST-1的表達(dá)發(fā)現(xiàn),高轉(zhuǎn)移5-8F細(xì)胞TPST-1的mRNA水平和蛋白水平均高于6-10B細(xì)胞。進(jìn)一步抑制5-8F的TPST-1可以抑制其CXCR4的硫酸化水平,而在6-10B細(xì)胞中轉(zhuǎn)染TPST-1表達(dá)質(zhì)粒可以上調(diào)CXCR4的硫酸化水平。近年來,在人們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表面的膜受體EGFR和FGFR能夠移位入核之后,新近有研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜表面受體CXCR4同樣能夠入核。我們首先檢測(cè)高轉(zhuǎn)移和不轉(zhuǎn)移的5-8F細(xì)胞和6-10B細(xì)胞的CXCR4是否存在核定位,采用亞細(xì)胞組分結(jié)合Western Blot及激光共聚焦技術(shù),從定性和定量水平均發(fā)現(xiàn)5-8F細(xì)胞核內(nèi)存在CXCR4蛋白的表達(dá)。進(jìn)一步利用特異性硫酸化抑制劑和TPST-1 siRNA處理5-8F細(xì)胞后,SDF-1α30nm刺激細(xì)胞30min,發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞核內(nèi)的CXCR4蛋白明顯減少。提示,CXCR4的核移位與CXCR4的硫酸化密切相關(guān)。 2.EB病毒LMP1通過調(diào)節(jié)CXCR4功能活性促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移 上一個(gè)部分我們?cè)?-8F和6-10B細(xì)胞中研究發(fā)現(xiàn)CXCR4的硫酸化與鼻咽癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。我們實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)LMP1在高轉(zhuǎn)移5-8F細(xì)胞的表達(dá)高于不轉(zhuǎn)移6-10B細(xì)胞,結(jié)合LMP1在鼻咽癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用,提示我們：在鼻咽癌細(xì)胞中,LMP1可能是通過對(duì)CXCR4硫酸化的調(diào)控,進(jìn)而影響鼻咽癌的轉(zhuǎn)移。 首先應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步確證高硫酸化的5-8F細(xì)胞高表達(dá)LMP1后,采用可調(diào)控LMP1表達(dá)的細(xì)胞系,本研究發(fā)現(xiàn)在鼻咽癌細(xì)胞系中LMP1可誘導(dǎo)CXCR4的表達(dá),并呈劑量誘導(dǎo)效應(yīng)。進(jìn)一步采用免疫共沉淀將CXCR4沉淀分離后,Western Blot檢測(cè)酪氨酸硫酸化水平即CXCR4硫酸化變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨DOX劑量的增加,CXCR4的硫酸化也隨之增加。提示,LMP1能夠上調(diào)CXCR4的硫酸化。同樣我們應(yīng)用Tet-on LMP1 HNE2細(xì)胞,用不同DOX劑量誘導(dǎo)24h后,在不同濃度的SDF-1α的作用下,進(jìn)行趨化實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)LMP1能夠上調(diào)CXCR4的趨化活性,說明LMP1通過上調(diào)CXCR4硫酸化進(jìn)而影響其功能活性。 業(yè)已證實(shí)LMP1調(diào)控CXCR4的硫酸化及其功能活性,那么我們將探討LMP1是否誘導(dǎo)CXCR4核移位。采用亞細(xì)胞組分結(jié)合Western Blot及激光共聚焦技術(shù),我們從定性和定量水平均發(fā)現(xiàn)Tet-on LMP1HNE2細(xì)胞核內(nèi)部分存在CXCR4的蛋白表達(dá),且隨LMP1表達(dá)的增加而增加。進(jìn)一步我們?cè)赥et-on LMP1 HNE2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-CXCR4和MUT-CXCR4表達(dá)質(zhì)粒24h后,分別在DOX (0,6ug/ml)劑量誘導(dǎo)下,采用亞細(xì)胞組分結(jié)合激光共聚焦技術(shù),我們從定性水平發(fā)現(xiàn)LMP1促進(jìn)了WT-CXCR4組細(xì)胞CXCR4蛋白的核積聚。這些結(jié)果表明LMP1通過調(diào)控CXCR4的硫酸化進(jìn)而影響CXCR4的核移位。 最后利用HNE2-PSG5和HNE2-LMP1細(xì)胞,分別轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-CXCR4和MUT-CXCR4表達(dá)質(zhì)粒24h后,Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LMP1促進(jìn)轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-CXCR4質(zhì)粒組細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力,并沒有影響MUT-CXCR4質(zhì)粒組細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力。進(jìn)一步說明LMP1通過誘導(dǎo)CXCR4第21位酪氨酸硫酸化功能活性進(jìn)而促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。 3.EB病毒LMP1通過EGFR介導(dǎo)CXCR4硫酸化 我們的前期工作證實(shí)LMP1上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子EGFR的表達(dá),而且我們通過基因信息學(xué)發(fā)現(xiàn)酪氨酰蛋白硫酸轉(zhuǎn)移酶TPST-1的啟動(dòng)子區(qū)存在EGFR的結(jié)合位點(diǎn)。因此我們推測(cè)LMP1有可能是通過EGFR介導(dǎo)TPST-1上調(diào)CXCR4的硫酸化。 采用鼻咽癌Tet-on LMP1 HNE2細(xì)胞,應(yīng)用Real-time-PCR和Western Blot技術(shù)發(fā)現(xiàn)LMP1上調(diào)TPST-1的mRNA和蛋白水平,EGFR siRNA處理Tet-on LMP1 HNE2細(xì)胞24h阻斷EGFR表達(dá)后,TPST-1表達(dá)下調(diào),初步說明LMP1誘導(dǎo)的TPST-1是EGFR所依賴的。 采用ChIP發(fā)現(xiàn),LMP1可以促進(jìn)EGFR與TPST-1的結(jié)合,采用報(bào)告基因分析發(fā)現(xiàn),LMP1增加TPST-1啟動(dòng)子活性,而突變EGFR與TPST-1的結(jié)合位點(diǎn),我們發(fā)現(xiàn)LMP1增加的TPST-1啟動(dòng)子活性顯著下調(diào)。進(jìn)一步說明LMP1誘導(dǎo)的TPST-1和CXCR4的硫酸化是EGFR所依賴的。 小結(jié)：我們以鼻咽癌細(xì)胞系為基本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?從比較具有不同轉(zhuǎn)移潛能的鼻咽癌細(xì)胞系之間CXCR4硫酸化狀態(tài)的差異入手,進(jìn)行LMP1對(duì)CXCR4硫酸化及亞細(xì)胞定位和功能的研究,本研究主要采用阻斷策略結(jié)合Western Blotting、趨化實(shí)驗(yàn)、侵襲實(shí)驗(yàn)、ChIP、體外定點(diǎn)突變等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法,從蛋白硫酸化修飾的角度來闡明LMP1調(diào)節(jié)CXCR4的分子機(jī)制,取得如下重要的創(chuàng)新性發(fā)現(xiàn)： 1.首次發(fā)現(xiàn)CXCR4的硫酸化可以促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。抑制高轉(zhuǎn)移5-8F細(xì)胞的硫酸化可以抑制其CXCR4的趨化活性和細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力,且轉(zhuǎn)染野生型的CXCR4表達(dá)質(zhì)�？梢源龠M(jìn)不轉(zhuǎn)移的6-10B細(xì)胞CXCR4的趨化活性和細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力。高轉(zhuǎn)移鼻咽癌細(xì)胞高表達(dá)硫酸化轉(zhuǎn)移酶TPST-1,且TPST-1siRNA可以有效的阻斷CXCR4的硫酸化。首次發(fā)現(xiàn)鼻咽癌5-8F細(xì)胞核內(nèi)存在CXCR4蛋白的表達(dá)。利用特異性硫酸化抑制劑和TPST-1siRNA抑制CXCR4的硫酸化可有效阻斷5-8F細(xì)胞CXCR4蛋白核移位。 2.首次發(fā)現(xiàn)EB病毒LMP1上調(diào)CXCR4的硫酸化水平、功能活性和促進(jìn)CXCR4蛋白的核移位,并呈一定劑量效應(yīng)。且發(fā)現(xiàn)LMP1調(diào)控CXCR4核移位是通過其上調(diào)CXCR4的硫酸化實(shí)現(xiàn)的。同時(shí)發(fā)現(xiàn)LMP1上調(diào)CXCR4的硫酸化與鼻咽癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)。 3.首次發(fā)現(xiàn)LMP1可以上調(diào)TPST-1的mRNA和蛋白表達(dá)水平,并呈劑量依賴效應(yīng)。EGFR siRNA可以抑制LMP1上調(diào)的TPST-1表達(dá)。在LMP1調(diào)控下,轉(zhuǎn)錄因子EGFR與TPST-1的啟動(dòng)子結(jié)合增強(qiáng)。并發(fā)現(xiàn)LMP1增加TPST-1啟動(dòng)子活性,突變EGFR在TPST-1啟動(dòng)子上的結(jié)合位點(diǎn)可以下調(diào)LMP1調(diào)控的TPST-1的啟動(dòng)子活性。 本論文以EBV的致瘤蛋白LMP1通過轉(zhuǎn)錄因子EGFR對(duì)酪氨酸硫酸化轉(zhuǎn)移酶TPST-1的調(diào)控為切入點(diǎn),從CXCR4硫酸化翻譯后修飾的角度來闡明LMP1-EGFR-TPST-1-CXCR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在鼻咽癌轉(zhuǎn)移中的分子機(jī)制及其生物學(xué)意義。通過本研究,將EB病毒與趨化因子及其受體通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)聯(lián)系起來,提出了新的工作模式。為EB病毒致瘤分子機(jī)理研究開拓一個(gè)新的視野,為靶向LMP1和CXCR4抗信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)治療腫瘤提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù),這將有助于從分子水平揭示鼻咽癌轉(zhuǎn)移發(fā)生機(jī)制,為鼻咽癌的防治提供新的理論依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R739.63

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2378785