【摘要】：濾過性手術(shù)仍是目前眼壓不能控制的青光眼的主要治療手段。術(shù)后濾過通道的瘢痕化導致術(shù)后2年的手術(shù)失敗率達15%～25%。影響濾過通道瘢痕化的危險因素有多種,包括年輕人、濾過手術(shù)史、術(shù)前長期使用有防腐劑的滴眼液、伴葡萄膜炎、眼前段新生血管形成等病史。各種原因?qū)е聻V過手術(shù)失敗的共同點是濾過通道的成纖維細胞過度增殖,導致過度纖維化反應(yīng)、瘢痕形成。其細胞學基礎(chǔ)就是在TGF-β為主的細胞因子介導下,成纖維細胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞,并合成過量的膠原蛋白等細胞外基質(zhì)。最近的研究發(fā)現(xiàn),p38 MAPK信號通道在成纖維細胞表型轉(zhuǎn)化過程中起著重要的作用。本研究初步觀察了抑制p38 MAPK信號通道對兔小梁切除術(shù)后纖維化反應(yīng)的作用,說明p38MAPK信號通道可作為新的抗瘢痕化作用靶點；在體外培養(yǎng)了人Tenon's囊成纖維細胞,證實了p38 MAPK信號通道參與了TGF-β1誘導下的成纖維細胞向肌成纖維細胞分化；設(shè)計、合成了特異性沉默p38 MAPK表達的siRNA,初步探討了RNA干擾p38 MAPK信號通道對TGF-β1誘導下成纖維細胞增殖、表型轉(zhuǎn)化的抑制作用。 一、抑制p38 MAPK信號途徑對兔小梁切除手術(shù)后纖維化反應(yīng)的作用 目的：觀察p38 MAPK抑制劑SB203580對兔小梁切除術(shù)后纖維化反應(yīng)的作用。方法：將12只兔24眼隨機分為3組：A組(單純小梁切除術(shù)組)、B組(小梁切除術(shù)+SB203580組)、C組(小梁切除術(shù)+MMC組)。對各組進行裂隙燈顯微鏡觀察、眼壓檢查、濾過區(qū)結(jié)膜組織學和透射電鏡觀察、免疫組織化學法檢查濾過區(qū)α-SMA表達、Elisa檢測房水及濾過區(qū)結(jié)膜組織的α-SMA、纖維連接蛋白含量、熒光實時定量PCR檢測各組術(shù)區(qū)結(jié)膜組織ACTA2、CTGF、COL1A2的mRNA表達。 結(jié)果：術(shù)后14天A組濾過泡血管化、瘢痕形成,B組濾過泡扁平彌散,C組濾過泡蒼白缺血狀、扁平彌散。不同時間點各組之間眼壓無明顯差異。濾過泡組織學及透射電鏡觀察檢查可見不同組間結(jié)膜上皮細胞、成纖維細胞和上皮下纖維組織形態(tài)不同。免疫組織化學法觀察見A組纖維組織間大量的棕黃色α-SMA陽性細胞,B、C組陽性細胞數(shù)量減少。Elisa檢測各組房水及結(jié)膜的α-SMA及FN的含量差異有統(tǒng)計學意義,熒光實時定量PCR檢測各組結(jié)膜組織ACTA2、CTGF、COL1A2的mRNA表達差異有顯著性,各指標均為A組最高,B組次之,C組最低。 結(jié)論：p38 MAPK抑制劑SB203580能減輕兔小梁切除術(shù)后纖維化反應(yīng),抑制p38MAPK信號通道可作為新的抗瘢痕化途徑。二、體外培養(yǎng)人Tenon's囊成纖維細胞及誘導表型轉(zhuǎn)化 目的：體外培養(yǎng)和鑒定人Tenon's囊成纖維細胞(Human Tenon's Fibroblast, HTF),觀察TGF-β1誘導的HTF表型轉(zhuǎn)化特征。 方法：取材人Tenon's囊組織,組織貼塊法培養(yǎng)傳代。倒置顯微鏡觀察HTF形態(tài)特點,免疫組織化學法波形蛋白及角蛋白染色鑒定細胞來源,細胞計數(shù)法繪制生長曲線。Western Blot檢測TGF-β1刺激下的信號通道蛋白p38MAP、Smad2的變化,熒光實時定量PCR檢測肌成纖維細胞分化標志α-SMA、CTGF、COL1A2的nRNA表達,Elisa檢測α-SMA和纖維連接蛋白的含量,流式細胞儀檢測細胞凋亡。 結(jié)果：顯微鏡下可見細胞呈長梭形或多突起的星形,貼壁生長。免疫組織化學染色波形蛋白為陽性,角蛋白陰性。生長曲線表明培養(yǎng)第2-8天為對數(shù)生長期。TGF-β1刺激使p38 MAPK、Smad2信號通道活化,ACTA2、CTGF、COL1A2 mRNA表達增強,α-SMA和纖維連接蛋白的含量增加,細胞凋亡減少。 結(jié)論：通過人Tenon's囊組織貼塊培養(yǎng)可獲得生長穩(wěn)定、成分純凈的HTF。TGF-β1刺激可促使成纖維細胞增殖、分化,合成細胞外基質(zhì),p38 MAPK信號途徑參與了這個過程。 三、沉默p38 MAPK表達的siRNA對TGF-β1誘導下的人Tenon's囊成纖維細胞的作用 目的：設(shè)計合成p38 MAPK siRNA,篩選獲得高效、特異的siRNA,觀察沉默p38MAPK表達對TGF-β1誘導下的HTF增殖和表型轉(zhuǎn)化的抑制作用。 方法：設(shè)計、合成三對靶向p38 MAPK的siRNA,(?)日離子脂質(zhì)體lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的HTF,采用Western blot測定p38 MAPK表達抑制情況,流式細胞儀檢測細胞凋亡情況,MTT法檢測細胞活力篩選出最佳siRNA。以篩選出來的siRNA體外轉(zhuǎn)染HTF,同時設(shè)對任何基因無作用的siRNA作為陰性對照。TGF-β1刺激下,Westernblot觀察p38MAPK、Smad2信號通道改變,熒光實時定量PCR檢測ACTA2、CTGF、COL1A2的mRNA表達,Elisa檢測α-SMA和纖維連接蛋白的含量,MTT法測定細胞活力,原子力顯微鏡觀察細胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)。 結(jié)果：siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3對p38 MAPK的抑制率分別為71.01%、68.65%、86.87%,與單純TGF-β1刺激的凋亡率差分別為2.01%、1.72%、3.59%。三種siRNA對細胞活力抑制作用差異無顯著性。轉(zhuǎn)染p38 MAPK siRNA-3后,TGF-β1誘導的p38MAPK的表達顯著降低,Smad2信號通道先下降后升高趨勢,差異具有顯著性：明顯減少了ACTA2、CTGF、COL1A2的mRNA表達,降低了α-SMA、FN的濃度,差異有統(tǒng)計學意義。轉(zhuǎn)染后TGF-β1刺激的時間因素與ACTA2、CTGF、COL1A2的mRNA表達存在交互作用,時間因素與α-SMA、FN的含量有交互作用,并且這種交互作用呈線性或二次項趨勢。轉(zhuǎn)染后TGF-β1刺激下的細胞活力被明顯抑制。RNA干擾p38 MAPK對成纖維細胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)有明顯影響。 結(jié)論：設(shè)計合成的三種siRNA均具有p38 MAPK基因沉默效果,其中以siRNA-3效果最佳。靶向沉默p38MAPK表達的siRNA能有效抑制TGF-β1誘導的HTF增殖和表型轉(zhuǎn)化。
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【學位授予單位】：暨南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R779.6

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前5條

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本文編號：2357236