【摘要】： 背景與目的：惡性腫瘤主要表現(xiàn)為細(xì)胞失去控制無(wú)限制地增長(zhǎng)和／或凋亡通路受阻導(dǎo)致細(xì)胞堆積,而端粒酶的活化是使細(xì)胞獲得無(wú)限增殖能力成為永生化細(xì)胞的關(guān)鍵因素之一。80-96%原發(fā)性喉鱗狀細(xì)胞癌有端粒酶活性表達(dá)。端粒酶延長(zhǎng)端粒使端粒結(jié)構(gòu)維持相對(duì)穩(wěn)定的機(jī)制是：端粒酶—RNA依賴的DNA多聚酶,催化TTAGGG加在染色體末端,從而維持端粒的長(zhǎng)度,使細(xì)胞保持旺盛的分裂增殖能力。在各國(guó)學(xué)者的努力下,端粒酶途徑維持端粒長(zhǎng)度的機(jī)制已經(jīng)被闡明,其關(guān)鍵蛋白是人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)。 雖然端粒酶是保持惡性腫瘤細(xì)胞端粒DNA長(zhǎng)度穩(wěn)定的最主要途徑,但它不是唯一的途徑。研究發(fā)現(xiàn)某些缺乏端粒酶活性的腫瘤細(xì)胞也能夠永生,而且具有長(zhǎng)短不一的端粒DNA,這類腫瘤細(xì)胞保持端粒DNA長(zhǎng)度穩(wěn)定的機(jī)制被稱為端粒延長(zhǎng)替代機(jī)制(alternative lengthening of telomeres, ALT)。大約有15%的惡性腫瘤細(xì)胞依賴ALT機(jī)制維持端粒結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。ALT機(jī)制在同一惡性腫瘤細(xì)胞中可以與端粒酶機(jī)制共存或者互換,即在某些腫瘤細(xì)胞中端粒結(jié)構(gòu)穩(wěn)定可能是由端粒酶機(jī)制和ALT機(jī)制共同維持,而抑制端粒酶途徑后腫瘤細(xì)胞有可能依賴ALT機(jī)制而維持端粒結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。 前期研究中,我們根據(jù)RNAi原理設(shè)計(jì)并構(gòu)建了能表達(dá)短發(fā)夾RNA (short hairpin, shRNA)的質(zhì)粒pshRNA-TERT,其靶基因?yàn)閔TERT mRNA。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的喉鱗癌Hep-2細(xì)胞,觀察到癌細(xì)胞hTERT基因表達(dá)顯著下降、端粒酶失活,細(xì)胞生長(zhǎng)增殖明顯受到抑制。端粒酶活性受抑制初期發(fā)現(xiàn)每天均有許多凋亡、死亡細(xì)胞出現(xiàn),存活細(xì)胞逐漸減少。但是從治療后8天起凋亡、死亡細(xì)胞很少出現(xiàn),存活細(xì)胞維持相對(duì)穩(wěn)定,約占癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖高峰期的10%。實(shí)驗(yàn)得出了一個(gè)重要的結(jié)論：端粒酶活性受抑制后仍有少量喉癌細(xì)胞可以繼續(xù)存活。該結(jié)果很好地解釋了迄今為止為何各種抑制端粒酶活性的基因治療方法都只能抑制部分癌細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖、未能達(dá)到完全治愈腫瘤的困惑：端粒酶被抑制后一段時(shí)間,其它端粒維持機(jī)制可能已激活或?qū)⒈患せ?因此端粒結(jié)構(gòu)繼續(xù)得到維持,癌細(xì)胞繼續(xù)存活并增殖。 喉癌是頭頸部第二位原發(fā)于上皮的常見(jiàn)惡性腫瘤。同其它腫瘤一樣,其發(fā)病率有明顯上升趨勢(shì)。功能性喉癌外科的開(kāi)展,使患者得以獲得較高的五年生存率及滿意的生存質(zhì)量。但仍有不少患者,雖經(jīng)根治手術(shù)和放化療,因局部復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移而難以救治以致死亡。當(dāng)術(shù)后復(fù)發(fā)和出現(xiàn)轉(zhuǎn)移時(shí),腫瘤對(duì)放、化療多不敏感,預(yù)后很差。因此,尋找出一種新的、有效的、特異性的治療途徑挽救或延長(zhǎng)這類患者的生命具有十分重要的意義。 因此,本研究中我們對(duì)端粒酶活性受抑制后的喉癌細(xì)胞進(jìn)行深入探討：從生物學(xué)行為變化入手研究治療后存活細(xì)胞的轉(zhuǎn)歸；從端粒維持機(jī)制變化入手研究其轉(zhuǎn)歸的機(jī)制,從維持端粒關(guān)鍵物質(zhì)入手研究其起作用的核心蛋白。 目的：運(yùn)用RNA干擾技術(shù)抑制喉癌細(xì)胞端粒酶活性,收集并研究存活喉癌細(xì)胞的特性及轉(zhuǎn)歸。通過(guò)端粒動(dòng)力學(xué)和腫瘤特性的研究,明確存活細(xì)胞在端粒維持機(jī)制及腫瘤特性上的轉(zhuǎn)變。通過(guò)比較兩種細(xì)胞中差異蛋白的表達(dá),篩選出端粒維持機(jī)制中的關(guān)鍵蛋白,為喉癌細(xì)胞的基因治療提供新的靶點(diǎn)和方向。 方法：構(gòu)建靶向端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的質(zhì)粒pshRNA,導(dǎo)入喉癌細(xì)胞后用流式細(xì)胞儀分選和收集干擾成功的細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)該細(xì)胞,檢測(cè)其生長(zhǎng)情況,穩(wěn)定傳代后,分別檢測(cè)端粒酶活性、hTERT的表達(dá)及APBs小體表達(dá)情況,明確存活細(xì)胞的端粒維持特性。FLOW-FISH技術(shù)檢測(cè)喉癌細(xì)胞和存活細(xì)胞端粒長(zhǎng)度變化,CO-FISH法檢測(cè)細(xì)胞中T-SCE水平,Transwell實(shí)驗(yàn)和裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)比較兩種細(xì)胞在侵襲力和成瘤性上的差異。運(yùn)用二維電泳(2-DE)和質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF-MS)技術(shù),篩選與鑒定出喉癌細(xì)胞和存活細(xì)胞核中的差異蛋白,并運(yùn)用Westernblot法驗(yàn)證差異蛋白的表達(dá)。 結(jié)果：喉癌細(xì)胞端粒酶活性被抑制后,流式細(xì)胞儀分選出有綠色熒光表達(dá)的干擾成功細(xì)胞。干擾初期,該細(xì)胞在增殖的同時(shí)伴有大量的衰老和凋亡,但仍有少量細(xì)胞可以存活,15天左右該細(xì)胞開(kāi)始穩(wěn)定傳代生長(zhǎng)。檢測(cè)存活細(xì)胞的特性發(fā)現(xiàn),該細(xì)胞沒(méi)有端粒酶活性,hTERT表達(dá)比喉癌細(xì)胞明顯減弱,同時(shí)伴有APBs小體表達(dá)增高,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。存活細(xì)胞的端粒長(zhǎng)度比喉癌細(xì)胞長(zhǎng),而且端粒結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)存活細(xì)胞具有ALT機(jī)制特異性的T-SCE結(jié)構(gòu)。Transwell實(shí)驗(yàn)和裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)證實(shí)存活細(xì)胞侵襲力和成瘤性比喉癌細(xì)胞弱,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。運(yùn)用二維電泳和質(zhì)譜技術(shù)并通過(guò)Westernblot驗(yàn)證,我們發(fā)現(xiàn)同喉癌細(xì)胞相比,存活細(xì)胞中SAGE1、GAS8、PML、SYCE1和NBS1表達(dá)增高(P0.05),提示這些蛋白可能為ALT機(jī)制的關(guān)鍵蛋白。相反,在喉癌細(xì)胞中存在TERT和：SMC1β蛋白的高表達(dá)(P0.05),提示這些蛋白可能為端粒酶延長(zhǎng)機(jī)制的關(guān)鍵蛋白。 結(jié)論：RNA干擾端粒酶活性后喉癌細(xì)胞仍有部分存活,該細(xì)胞能夠正常增殖而無(wú)端粒酶活性,且端粒延長(zhǎng)替代機(jī)制中關(guān)鍵物質(zhì)APBs小體表達(dá)增高,因此推測(cè)存活細(xì)胞利用非端粒酶途徑來(lái)維持端粒的穩(wěn)定。穩(wěn)定傳代的存活細(xì)胞具有相對(duì)較長(zhǎng)的端粒,端粒延長(zhǎng)可能依賴于T-SCE為基礎(chǔ)的端粒延長(zhǎng)替代機(jī)制,進(jìn)一步證實(shí)存活細(xì)胞具有ALT細(xì)胞的特性。侵襲力和成瘤性的改變提示存活的喉癌細(xì)胞可能發(fā)生了腫瘤特性的轉(zhuǎn)變。差異蛋白組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞中存在的差異蛋白可能為端粒酶途徑和端粒延長(zhǎng)替代機(jī)制中起作用的關(guān)鍵蛋白。這些關(guān)鍵蛋白的發(fā)現(xiàn)為以端粒為靶點(diǎn)的腫瘤基因治療提供新的靶點(diǎn)和方向。 綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果,本研究抑制喉癌細(xì)胞的端粒酶活性,收集存活的喉癌細(xì)胞進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),細(xì)胞沒(méi)有端粒酶活性,hTERT表達(dá)下降,同時(shí)伴有APBs小體表達(dá)增高。端粒動(dòng)力學(xué)研究也發(fā)現(xiàn)存活細(xì)胞具有特異性的端粒姐妹染色體重組現(xiàn)象,端粒長(zhǎng)度增加,這些都證實(shí)存活細(xì)胞具有ALT細(xì)胞的特征。存活細(xì)胞也可能發(fā)生了腫瘤特性的減弱。此外,蛋白組學(xué)研究鑒別出喉癌細(xì)胞和存活細(xì)胞存在數(shù)種差異蛋白,這些蛋白可能是端粒酶機(jī)制以及端粒延長(zhǎng)替代機(jī)制中起作用的關(guān)鍵蛋白。研究的結(jié)果為今后以端粒為靶點(diǎn)的腫瘤基因治療提供新的靶點(diǎn)和方向。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R739.65

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8 袁s，

本文編號(hào)：2342367