【摘要】：喉癌是頭頸部第二常見的原發(fā)惡性腫瘤。早期喉癌通過手術(shù)和放療預(yù)后較好,但晚期喉癌5年生存率僅有51%左右。近年來手術(shù)、放療技術(shù)的提高以及同步放化療的開展,在一定程度上改善了喉癌的預(yù)后,但由于相當(dāng)一部分喉癌患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已為晚期,且對(duì)于局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的患者治療上無重大進(jìn)展,因此近幾十年來喉癌的生存率一直沒有明顯的提高。為了能早期發(fā)現(xiàn)喉癌并改善其治療效果和預(yù)后,就需要我們更深入的了解喉癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)理。 microRNA是一類進(jìn)化上保守的內(nèi)源性非蛋白質(zhì)編碼小分子RNA,長度約為20-24個(gè)核苷酸,通過與mRNA互補(bǔ)結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的表達(dá)。大量研究表明,miRNA在腫瘤組織和正常組織之間的表達(dá)存在差異,并且發(fā)揮著類似癌基因或者抑癌基因的作用。最近已有研究報(bào)道了在頭頸腫瘤中差異表達(dá)的miRNAs,但相關(guān)miRNA在頭頸腫瘤中的具體功能及分子機(jī)制的研究仍留有很大空白。本研究旨在初步探討miRNA在喉癌發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)功能及其內(nèi)在分子機(jī)制,為尋找喉癌早期腫瘤分子標(biāo)志物及后續(xù)的喉癌基因治療奠定基礎(chǔ),以最終提高喉癌的早期診斷率并改善治療效果。結(jié)合文獻(xiàn),本實(shí)驗(yàn)選取在頭頸腫瘤組織中高表達(dá)的miR-9和低表達(dá)的miR-125b進(jìn)行研究,并將唯一一個(gè)已證實(shí)在喉癌中高表達(dá)且有明確生物學(xué)功能的miR-21作為整個(gè)實(shí)驗(yàn)的陽性對(duì)照。 我們首先用real-time PCR的方法檢測了miR-9、miR-125b和miR-21在10對(duì)配對(duì)喉鱗癌和癌旁正常組織、人喉癌細(xì)胞株Hep-2和10例正常組織中的表達(dá)差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在喉鱗癌組織和人喉癌細(xì)胞株Hep-2中miR-9和miR-21表達(dá)上調(diào),miR-125b表達(dá)下調(diào),與文獻(xiàn)報(bào)道的用miRNA芯片技術(shù)檢測的結(jié)果相符。隨后,我們?cè)谌撕戆┘?xì)胞株Hep-2中轉(zhuǎn)染miR-9 ASO、miR-21 ASO、miR-125b成熟序列以及相應(yīng)對(duì)照,并用MTT實(shí)驗(yàn)分析轉(zhuǎn)染后對(duì)細(xì)胞增殖的影響。發(fā)現(xiàn)在Hep-2細(xì)胞中敲低miR-9和miR-21后72小時(shí)和96小時(shí)測得的活細(xì)胞數(shù)目明顯減少,而過表達(dá)miR-125b后活細(xì)胞數(shù)目雖有所減少,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 為了明確在Hep-2細(xì)胞中敲低miR-9和miR-21后活細(xì)胞數(shù)目明顯減少是通過哪條途徑實(shí)現(xiàn)的,我們進(jìn)一步用流式細(xì)胞術(shù)分析了敲低miR-9、miR-21和過表達(dá)miR-125b后Hep-2細(xì)胞周期的變化。結(jié)果提示,在Hep-2中敲低miR-9和miR-21后,G1期所占的百分比增加,S期和G2期相應(yīng)減少。而過表達(dá)miR-125b對(duì)細(xì)胞周期影響不明顯。抑制細(xì)胞增殖的作用除了通過抑制細(xì)胞從G0/G1期發(fā)展到S期,還可能通過促進(jìn)凋亡來實(shí)現(xiàn)。為此我們用TUNEL實(shí)驗(yàn)分析了在Hep-2細(xì)胞中敲低miR-9和過表達(dá)miR-125b后對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中凋亡細(xì)胞數(shù)目無明顯差異。此外,為了檢測miR-9對(duì)Hep-2細(xì)胞存活能力的影響,我們還進(jìn)行了細(xì)胞存活能力的實(shí)驗(yàn)(Survival實(shí)驗(yàn))。結(jié)果顯示在無血清培養(yǎng)基中,和對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染miR-9 ASO后Hep-2活細(xì)胞數(shù)量減少,說明敲低miR-9后Hep-2細(xì)胞的存活能力降低。 由于miRNAs往往通過調(diào)控下游靶基因發(fā)揮作用,為了進(jìn)一步闡述miR-9在喉鱗癌中發(fā)揮功能的分子機(jī)制,我們利用生物信息學(xué)的方法首先分析了miR-9在人類基因組中的位置及其序列的保守性,隨后通過miRanda、TargetScan和PicTar軟件對(duì)miR-9可能的靶基因進(jìn)行了預(yù)測。 綜合以上結(jié)果,我們初步證明：miR-9在喉鱗癌組織及人喉癌細(xì)胞株Hep-2中表達(dá)明顯上調(diào)。敲低miR-9可以通過調(diào)控細(xì)胞周期,使Hep-2細(xì)胞阻滯在Gl期而抑制Hep-2細(xì)胞增殖,同時(shí),敲低miR-9使Hep-2細(xì)胞的存活能力下降,但無明顯誘導(dǎo)凋亡的作用。因此,我們考慮miR-9在喉癌中可能發(fā)揮了類似“癌基因”的作用。miR-125b在喉鱗癌組織及人喉癌細(xì)胞株Hep-2中表達(dá)明顯下調(diào),但在人喉癌Hep-2細(xì)胞中過表達(dá)miR-125b無明顯的生物學(xué)效應(yīng)。作為整個(gè)實(shí)驗(yàn)陽性對(duì)照的miR-21的結(jié)果與之前文獻(xiàn)的報(bào)道均相符,間接證明了本實(shí)驗(yàn)的可靠性。生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-9的靶基因共631個(gè),縮減了候選靶基因的范圍,為進(jìn)一步明確miR-9的靶基因并研究其作用機(jī)制提供了依據(jù)。
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【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R739.65

【參考文獻(xiàn)】

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1 劉天潤;楊安奎;陳福進(jìn);曾木圣;宋明;郭朱明;陳文寬;歐陽電;李秋梨;陳艷峰;張?jiān)?曾宗淵;;221例晚期喉鱗癌患者術(shù)后的生存和預(yù)后分析[J];癌癥;2009年03期

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本文編號(hào)：2340283