【摘要】：喉癌是頭頸部第二常見的原發(fā)惡性腫瘤。早期喉癌通過手術(shù)和放療預(yù)后較好,但晚期喉癌5年生存率僅有51%左右。近年來手術(shù)、放療技術(shù)的提高以及同步放化療的開展,在一定程度上改善了喉癌的預(yù)后,但由于相當一部分喉癌患者發(fā)現(xiàn)時已為晚期,且對于局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的患者治療上無重大進展,因此近幾十年來喉癌的生存率一直沒有明顯的提高。為了能早期發(fā)現(xiàn)喉癌并改善其治療效果和預(yù)后,就需要我們更深入的了解喉癌發(fā)生發(fā)展的機理。 microRNA是一類進化上保守的內(nèi)源性非蛋白質(zhì)編碼小分子RNA,長度約為20-24個核苷酸,通過與mRNA互補結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的表達。大量研究表明,miRNA在腫瘤組織和正常組織之間的表達存在差異,并且發(fā)揮著類似癌基因或者抑癌基因的作用。最近已有研究報道了在頭頸腫瘤中差異表達的miRNAs,但相關(guān)miRNA在頭頸腫瘤中的具體功能及分子機制的研究仍留有很大空白。本研究旨在初步探討miRNA在喉癌發(fā)生發(fā)展中的生物學功能及其內(nèi)在分子機制,為尋找喉癌早期腫瘤分子標志物及后續(xù)的喉癌基因治療奠定基礎(chǔ),以最終提高喉癌的早期診斷率并改善治療效果。結(jié)合文獻,本實驗選取在頭頸腫瘤組織中高表達的miR-9和低表達的miR-125b進行研究,并將唯一一個已證實在喉癌中高表達且有明確生物學功能的miR-21作為整個實驗的陽性對照。 我們首先用real-time PCR的方法檢測了miR-9、miR-125b和miR-21在10對配對喉鱗癌和癌旁正常組織、人喉癌細胞株Hep-2和10例正常組織中的表達差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在喉鱗癌組織和人喉癌細胞株Hep-2中miR-9和miR-21表達上調(diào),miR-125b表達下調(diào),與文獻報道的用miRNA芯片技術(shù)檢測的結(jié)果相符。隨后,我們在人喉癌細胞株Hep-2中轉(zhuǎn)染miR-9 ASO、miR-21 ASO、miR-125b成熟序列以及相應(yīng)對照,并用MTT實驗分析轉(zhuǎn)染后對細胞增殖的影響。發(fā)現(xiàn)在Hep-2細胞中敲低miR-9和miR-21后72小時和96小時測得的活細胞數(shù)目明顯減少,而過表達miR-125b后活細胞數(shù)目雖有所減少,但無統(tǒng)計學意義。 為了明確在Hep-2細胞中敲低miR-9和miR-21后活細胞數(shù)目明顯減少是通過哪條途徑實現(xiàn)的,我們進一步用流式細胞術(shù)分析了敲低miR-9、miR-21和過表達miR-125b后Hep-2細胞周期的變化。結(jié)果提示,在Hep-2中敲低miR-9和miR-21后,G1期所占的百分比增加,S期和G2期相應(yīng)減少。而過表達miR-125b對細胞周期影響不明顯。抑制細胞增殖的作用除了通過抑制細胞從G0/G1期發(fā)展到S期,還可能通過促進凋亡來實現(xiàn)。為此我們用TUNEL實驗分析了在Hep-2細胞中敲低miR-9和過表達miR-125b后對細胞凋亡的影響。結(jié)果顯示,實驗組和對照組中凋亡細胞數(shù)目無明顯差異。此外,為了檢測miR-9對Hep-2細胞存活能力的影響,我們還進行了細胞存活能力的實驗(Survival實驗)。結(jié)果顯示在無血清培養(yǎng)基中,和對照組相比,轉(zhuǎn)染miR-9 ASO后Hep-2活細胞數(shù)量減少,說明敲低miR-9后Hep-2細胞的存活能力降低。 由于miRNAs往往通過調(diào)控下游靶基因發(fā)揮作用,為了進一步闡述miR-9在喉鱗癌中發(fā)揮功能的分子機制,我們利用生物信息學的方法首先分析了miR-9在人類基因組中的位置及其序列的保守性,隨后通過miRanda、TargetScan和PicTar軟件對miR-9可能的靶基因進行了預(yù)測。 綜合以上結(jié)果,我們初步證明：miR-9在喉鱗癌組織及人喉癌細胞株Hep-2中表達明顯上調(diào)。敲低miR-9可以通過調(diào)控細胞周期,使Hep-2細胞阻滯在Gl期而抑制Hep-2細胞增殖,同時,敲低miR-9使Hep-2細胞的存活能力下降,但無明顯誘導(dǎo)凋亡的作用。因此,我們考慮miR-9在喉癌中可能發(fā)揮了類似“癌基因”的作用。miR-125b在喉鱗癌組織及人喉癌細胞株Hep-2中表達明顯下調(diào),但在人喉癌Hep-2細胞中過表達miR-125b無明顯的生物學效應(yīng)。作為整個實驗陽性對照的miR-21的結(jié)果與之前文獻的報道均相符,間接證明了本實驗的可靠性。生物信息學軟件預(yù)測miR-9的靶基因共631個,縮減了候選靶基因的范圍,為進一步明確miR-9的靶基因并研究其作用機制提供了依據(jù)。
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【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R739.65

【參考文獻】

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1 劉天潤;楊安奎;陳福進;曾木圣;宋明;郭朱明;陳文寬;歐陽電;李秋梨;陳艷峰;張詮;曾宗淵;;221例晚期喉鱗癌患者術(shù)后的生存和預(yù)后分析[J];癌癥;2009年03期

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本文編號：2340283