【摘要】： 鼻咽癌(Nasoparyngeal carcinoma, NPC)是我國南方一些省(自治區(qū))的常見惡性腫瘤之一。目前放射治療是鼻咽癌治療的基本方法,但中晚期鼻咽癌治療后常常復(fù)發(fā)或向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,對于復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的患者在臨床上尚無有效治療方案。樹突狀細(xì)胞(Dendritic cell, DC)為基礎(chǔ)的疫苗在治療腫瘤方面,尤其在某些晚期腫瘤如黑色素瘤、前列腺癌、結(jié)腸癌、尿道癌的臨床治療方面已經(jīng)取得一些的成效,現(xiàn)在已進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗(yàn)。但DC在治療NPC方面,還處于起始階段。 目前治療用的DC是其前體細(xì)胞在細(xì)胞因子作用下體外誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得的,但對于DC誘導(dǎo)培養(yǎng)條件文獻(xiàn)報(bào)道不一。本研究首先通過對DC培養(yǎng)條件、前體細(xì)胞來源、細(xì)胞因子組合、細(xì)胞貼壁孵育時(shí)間、rAd-LMP2感染DC劑量,細(xì)胞凍融方面的進(jìn)行探索,優(yōu)化了DC培養(yǎng)條件。 我們課題組以rAd-LMP2以灌胃、肌肉注射和滴鼻的方式感染小鼠,均可誘發(fā)小鼠針對LMP2的特異性體液免疫和細(xì)胞免疫；EBV-LMP2 DNA疫苗、腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus,AAV)疫苗、非復(fù)制5型腺病毒疫苗(Ad5)聯(lián)合免疫Balb/C小鼠能夠更好地誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性CTL。rAd-LMP2、rAd5F35-LMP2肌肉免疫恒河猴誘導(dǎo)EBV-LMP2特異性的CTL。pcDNAⅢ-LMP2真核表達(dá)質(zhì)粒免疫小鼠可誘發(fā)LMP2特異性細(xì)胞和體液免疫。在此基礎(chǔ)上,我們以DC-LMP2肌肉免疫方式,研究LMP2誘導(dǎo)的特異性CTL。 通過與廣西自治區(qū)人民醫(yī)院合作,在獲得倫理委員會(huì)批準(zhǔn)下,依據(jù)自愿原則,選擇部分NPC治療進(jìn)行初步DC-LMP2皮內(nèi)免疫治療,首次以LMP2肽庫形式檢測DC-LMP2免疫后所激發(fā)LMP2特異性CTL,探討患者特異性CTL與NPC發(fā)展進(jìn)程的關(guān)系。 結(jié)果顯示：普通培養(yǎng)瓶誘導(dǎo)培養(yǎng)DC的效果最差,帶濾膜蓋的細(xì)胞培養(yǎng)瓶次之,六孔細(xì)胞培養(yǎng)板誘導(dǎo)培養(yǎng)效果最好。rmGM-CSF+rmIL-4+rmTNF-α組合對骨髓前體細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)DC的效果最好,終濃度為rmGM-CSF(200U)+rmIL-4(10U)+rmTNF-α(100U)/mL;對脾臟來源DC進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),rmGM-CSF+rmTNF-α組合的陽性率最高,但最終獲得DC數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于骨髓來源DC。隨著前體細(xì)胞孵育時(shí)間的增加獲得DC細(xì)胞數(shù)量也隨之增多,DC純度無明顯差異。rAd-LMP2感染骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)的DC,以10、100、1000 MOI感染DC,100 MOI感染DC效果最好,40-60%的DC中有LMP2表達(dá)。苔盼藍(lán)法檢測-80℃、-196℃凍存骨髓和脾臟淋巴細(xì)胞復(fù)蘇后存活率,骨髓細(xì)胞存活率(94.8±0.7%和82.85±3.8%)均大于脾臟細(xì)胞(80.98±2.2%和68.3±5.2%),DC前體細(xì)胞凍存復(fù)蘇影響其誘導(dǎo)培養(yǎng)。以優(yōu)化獲得的DC培養(yǎng)條件誘導(dǎo)培養(yǎng)骨髓來源的DC,然后DC-LMP2免疫BALB/C鼠可誘導(dǎo)LMP2特異性免疫應(yīng)答。第5周(308±167/106細(xì)胞,對照18±6/106細(xì)胞)強(qiáng)于第8周(196±81/106細(xì)胞,對照7±2/106細(xì)胞)；肌肉注射方式免疫小鼠rAd-LMP2、DC-LMP2所誘導(dǎo)的LMP2特異性CTL, rAd-LMP2組(1178±228/106細(xì)胞)大大高于DC-LMP2組((308±167/106細(xì)胞)。在小鼠0,2,4周免疫后的第五周,DC-LMP2免疫組CD8+T/CD3+T細(xì)胞亞群的比值(22.6±1.7%)高于PBS(20.4±3.5%)和DC組(22.04±1.2%),在第八周DC-LMP2免疫組CD8+T/CD3+T細(xì)胞亞群的比值(15.5±1.7%)低于PBS(17.6±2.9%)和DC組(17.5±1.5%)。在小鼠0,2,4周DC-LMP2免疫后,小鼠血清中產(chǎn)生LMP2抗體。 在NPC患者前臂內(nèi)側(cè)下緣皮內(nèi)免疫0.1 mL生理鹽水,含1-2×105個(gè)DC-LMP2,未出現(xiàn)明顯過敏反應(yīng),表明皮內(nèi)免疫DC-LMP2的途徑、部位、劑量安全可行。參加皮內(nèi)免疫的部分NPC患者,在在第五周LMP2特異性CTL檢測中,15人中9人提高了LMP2特異性CTL(/106),6人在DC-LMP2免疫后LMP2特異性CTL降低。1人在第八周的特異性細(xì)胞免疫水平高于治療前,1人低于治療前。在NPC免疫前后的IgA/VCA和IgA/EA抗體滴度無明顯改變,NPC患者經(jīng)過初次臨床常規(guī)治療后3-21個(gè)月內(nèi),血清中EBV DNA載量均低于103copies/mL。 總之,rmGM-CSF+rmIL-4+rmTNF-α組合對骨髓前體細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)DC的效果最好,終濃度為rmGM-CSF(200U)+rmIL-4(10U)+rmTNF-α(100U)/mL; DC-LMP2免疫BALB/C鼠可誘導(dǎo)LMP2特異性CTL。CD8+T/CD3+T細(xì)胞亞群的比值先升高。DC-LMP2免疫NPC患者的的途徑、部位、劑量安全可行,部分NPC患者提高了LMP2特異性CTL。
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【學(xué)位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R739.63

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2326234