【摘要】： 第一部分慢性高眼壓動物模型的建立和評估 目的：探討建立穩(wěn)定的大鼠慢性高眼壓模型的方法。 方法：成年雄性SD大鼠(250g左右)60只,以右眼為高眼壓眼,手術顯微鏡下分離上直肌兩側及鼻下方的3根鞏膜上靜脈,縫線結扎后縫合球結膜。左眼為對照眼,除不結扎靜脈外,其它操作相同。分別于術后30min、1d、3d、5d、7d、10d、14d、28d、35d和42d用Tono-penXL筆式眼壓計測量眼壓并記錄,測量時間為上午10點-11點。于術后2w和4w處死大鼠,處死前5天經(jīng)上丘行DiI逆行標記RGCs,制作視網(wǎng)膜鋪片,正置熒光顯微鏡觀察并計數(shù)分析各組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(retinal ganglion cells, RGCs)存活情況。結果：對照眼的平均眼壓為13.4±0.27 mm,術后30min、1d和3d檢測高眼壓眼的眼壓分別為21.4±0.25mmHg.25.5±0.27mmHg和23.4±0.19 mmHg,第5天達到最高值,為27.0±2.31 mmHg.隨后眼壓緩慢下降,第7d、10d、14d和28d分別測得眼壓值為：26.4±2.01 mmHg.26.8±1.83 mmHg、25.6±0.21 mmHg和23.6±0.17 mmHg,上述各時間點測得的眼壓數(shù)值與對照組相比均具有顯著性差異(P0.01)。術后第35d和42d時眼壓降至正常范圍,分別為14.7±0.31mmHg和15.9±0.26mmHg.視網(wǎng)膜鋪片DiI逆行標記計數(shù)分析RGCs結果顯示,對照眼RGCs的平均密度2201.45±124.67個／mm2,術后2周和4周,高眼壓眼RGCs的密度顯著減少,分別降到1974.30±108.81個／mm2和1732.96±89.14個/mm2,均明顯少于對照眼(P0.01)。 結論：結扎3條鞏膜外靜脈可以成功誘導SD大鼠慢性高眼壓,并可使眼壓穩(wěn)定維持到4周,是目前慢性高眼壓青光眼實驗研究中較為便捷、實用和可靠的建立動物模型的手段。經(jīng)大鼠上丘DiI逆行標記RGCs,結合形態(tài)學觀察,可以有效示蹤RGCs的形態(tài)和數(shù)量,是研究實驗條件下RGCs數(shù)量變化的較為理想的方法。 第二部分大鼠慢性高眼壓模型中視網(wǎng)膜Sonic Hedgehog(Shh)信號通路分子表達的研究 目的：研究Sonic Hedgehog及其下游信號通路分子Smoothened(Smo)、Patched(Ptc)和Glil在正常及慢性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜組織中的表達及變化。 方法：雄性SD大鼠60只,右眼為高眼壓組,結扎3根鞏膜上靜脈；左眼為對照組,除不結扎靜脈外,其它操作相同。建模成功的大鼠,分別于3d、1w、2w、4w各處死15只。其中3只用于視網(wǎng)膜Shh、受體Smo、Ptc以及核轉錄因子Glil的免疫熒光或免疫熒光雙標染色,正置熒光顯微鏡觀察呈現(xiàn)陽性熒光表達的細胞類型、數(shù)量及熒光強弱等；6只用于Western-blot方法定量檢測視網(wǎng)膜組織中上述四種蛋白的表達情況。余下6只大鼠視網(wǎng)膜用于實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應(real-time fluorescent quantitative reversetranscription polymerase chain reaction, Real-time PCR),定量分析高眼壓視網(wǎng)膜組織中Shh、Smo、Ptc和Glil的mRNA表達變化。Western-blot和Real-time PCR數(shù)據(jù)采用spss14.0軟件包進行統(tǒng)計分析,進行正態(tài)性檢驗、方差齊性檢驗,描述性統(tǒng)計值以平均值±標準誤(x±s)表示。兩組之間配對資料的t檢驗,組間差異比較用One-way ANOVA,P＜0.05有統(tǒng)計學意義。 結果：免疫熒光雙標顯示：對照組大鼠視網(wǎng)膜Shh主要在RGCs表達,內(nèi)叢狀層也可見到弱陽性的表達；2w時,高眼壓組在RGCs、內(nèi)叢狀層和外叢狀層都可以檢測到Shh表達,熒光強度明顯增加。對照組Glil和Smo在RGCs的細胞質(zhì)中有弱陽性表達,高眼壓組Glil陽性熒光信號同時出現(xiàn)在RGCs細胞質(zhì)和細胞核中。Real-time PCR結果顯示1w、2w、4w高眼壓組ShhmRNA分別是對照組的2.6±0.7、4.4±0.9和2.1±0.5倍,各時間點同對照組相比,差異有顯著性(P0.01), Smo和Gli1mRNA表達量于成模后1w開始升高,并于2w時到達高峰,隨后又減少,與對照組相比,差異均有顯著性(P0.01)。Ptc的蛋白和mRNA表達量在高眼壓組和對照組未見明顯差異。Western-blot結果顯示高眼壓組在1w、2w和4w視網(wǎng)膜Shh蛋白分別是對照組的2.1±0.3、4.4±0.6和3.0±0.7倍(P0.01),并于2w時達到高峰。視網(wǎng)膜Smo和Glil蛋白表達量在1w時開始增高,2w時到達高峰,隨后下降。在1w、2w和4w時,Smo蛋白表達分別是對照組的3.2±0.4倍(P0.05)、3.4±0.6倍(P0.01)和1.4±0.2倍(P0.05)；Glil蛋白表達量分別是對照組的1.6±0.1倍(P0.05)、2.5±0.3倍(P0.05)和2.0±0.5倍(P0.05)。 結論：大鼠慢性高眼壓動物模型視網(wǎng)膜組織中Shh及Smo、Gli1表達水平升高,Glil在RGC中呈現(xiàn)核轉位表達。提示慢性高眼壓時視網(wǎng)膜Shh信號轉導通路激活,可能參與慢性高眼壓視網(wǎng)膜視神經(jīng)損傷修復的生理病理過程。 第三部分：Shh信號轉導通路對大鼠慢性高眼壓RGCs損傷的作用及機制研究 目的：研究Shh信號轉導通路對大鼠慢性高眼壓RGCs損傷的作用,并探討其可能分子機制。 方法：成年雄性SD大鼠以右眼結扎3條鞏膜上靜脈誘導高眼壓形成。按照玻璃體腔內(nèi)注射藥物或濃度的不同將大鼠隨機分為9組：不注射組、10μg/ml Shh-N組、50μg/ml Shh-N組、100μg/ml Shh-N組、1.0μg/ml cyclopamine (Shh阻滯劑)組、5.0μg/ml cyclopamine組、5.0μg/ml tomatidine組(與Cyclopamine有相似的化學結構,但不能抑制Shh信號轉導通路,)、0.1M磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline, PBS)組、和45%(W/V)2-羥丙基-環(huán)糊精(2-hydroxypropyl-cyclodextrin, HBC)組,注射體積均為2μl。每周重復注射一次。檢測時間點為玻璃體腔注射后1w、2w和4w。在動物處死前5d,行DiI逆行標記RGCs。制作全視網(wǎng)膜鋪片正置熒光顯微鏡觀察RGCs的存活及數(shù)量,并提取視網(wǎng)膜蛋白和總RNA行Western-blot和Real-time PCR檢測信號通路中各成分含量的變化。 結果：眼壓升高后2w和4w時,玻璃體腔內(nèi)注射100μg/ml Shh-N組RGCs喪失率為分別為4.54±0.36%和9.67±0.31%,與PBS組(15.26±1.57%,22.58±1.97%)相比差異有顯著性(P0.01)；注射Shh-N50μg/ml RGCs喪失率分別為7.31±0.39%和12.67±0.29%,與PBS組(15.26±1.57%,22.58±1.97%)相比差異也有顯著性(P0.05);注射10μg/ml Shh-N組RGCs喪失率與PBS組相比無顯著性差異。玻璃體腔注射1.0μg/ml Cyclopamine組RGCs喪失率分別為19.29±0.43%(P0.05)和26.4±2.04%(P0.05),5.0μg/ml Cyclopamine組RGC喪失率分別為25.2±0.29%和30.7±0.31%,與HBC組相比差異均有顯著性(P0.01)。注射tomatidine組與注射PBS組相比,RGCs的喪失率無統(tǒng)計學差異。HBC組與未注射組RGCs數(shù)量無統(tǒng)計學差異。Shh對損傷RGC的保護作用及Cyclopamine的阻斷效應均呈劑量相關性,高濃度組效果更加顯著。玻璃體腔注射Shh-N 2w后,Western Blot結果顯示高眼壓眼視網(wǎng)膜Smo和Glil蛋白表達量增加,Real-timePCR結果：Smo mRNA和Gli1 mRNA分別為對照組的1.52±0.16%倍和1.96±0.31%倍。注射Cyclopamine后,高眼壓眼Smo和Glil蛋白和mRNA表達量分別降低。 結論外源性和內(nèi)源性Shh都可以在高眼壓引起的RGCs損傷中發(fā)揮保護作用,并呈劑量相關性,以高濃度為顯著。Shh可能通過釋放Smo,激活轉錄因子Glil發(fā)揮神經(jīng)保護作用。
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【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R775

【共引文獻】

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本文編號：2323778