【摘要】： 第一部分慢性高眼壓動(dòng)物模型的建立和評估 目的：探討建立穩(wěn)定的大鼠慢性高眼壓模型的方法。 方法：成年雄性SD大鼠(250g左右)60只,以右眼為高眼壓眼,手術(shù)顯微鏡下分離上直肌兩側(cè)及鼻下方的3根鞏膜上靜脈,縫線結(jié)扎后縫合球結(jié)膜。左眼為對照眼,除不結(jié)扎靜脈外,其它操作相同。分別于術(shù)后30min、1d、3d、5d、7d、10d、14d、28d、35d和42d用Tono-penXL筆式眼壓計(jì)測量眼壓并記錄,測量時(shí)間為上午10點(diǎn)-11點(diǎn)。于術(shù)后2w和4w處死大鼠,處死前5天經(jīng)上丘行DiI逆行標(biāo)記RGCs,制作視網(wǎng)膜鋪片,正置熒光顯微鏡觀察并計(jì)數(shù)分析各組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells, RGCs)存活情況。結(jié)果：對照眼的平均眼壓為13.4±0.27 mm,術(shù)后30min、1d和3d檢測高眼壓眼的眼壓分別為21.4±0.25mmHg.25.5±0.27mmHg和23.4±0.19 mmHg,第5天達(dá)到最高值,為27.0±2.31 mmHg.隨后眼壓緩慢下降,第7d、10d、14d和28d分別測得眼壓值為：26.4±2.01 mmHg.26.8±1.83 mmHg、25.6±0.21 mmHg和23.6±0.17 mmHg,上述各時(shí)間點(diǎn)測得的眼壓數(shù)值與對照組相比均具有顯著性差異(P0.01)。術(shù)后第35d和42d時(shí)眼壓降至正常范圍,分別為14.7±0.31mmHg和15.9±0.26mmHg.視網(wǎng)膜鋪片DiI逆行標(biāo)記計(jì)數(shù)分析RGCs結(jié)果顯示,對照眼RGCs的平均密度2201.45±124.67個(gè)／mm2,術(shù)后2周和4周,高眼壓眼RGCs的密度顯著減少,分別降到1974.30±108.81個(gè)／mm2和1732.96±89.14個(gè)/mm2,均明顯少于對照眼(P0.01)。 結(jié)論：結(jié)扎3條鞏膜外靜脈可以成功誘導(dǎo)SD大鼠慢性高眼壓,并可使眼壓穩(wěn)定維持到4周,是目前慢性高眼壓青光眼實(shí)驗(yàn)研究中較為便捷、實(shí)用和可靠的建立動(dòng)物模型的手段。經(jīng)大鼠上丘DiI逆行標(biāo)記RGCs,結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察,可以有效示蹤RGCs的形態(tài)和數(shù)量,是研究實(shí)驗(yàn)條件下RGCs數(shù)量變化的較為理想的方法。 第二部分大鼠慢性高眼壓模型中視網(wǎng)膜Sonic Hedgehog(Shh)信號通路分子表達(dá)的研究 目的：研究Sonic Hedgehog及其下游信號通路分子Smoothened(Smo)、Patched(Ptc)和Glil在正常及慢性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜組織中的表達(dá)及變化。 方法：雄性SD大鼠60只,右眼為高眼壓組,結(jié)扎3根鞏膜上靜脈；左眼為對照組,除不結(jié)扎靜脈外,其它操作相同。建模成功的大鼠,分別于3d、1w、2w、4w各處死15只。其中3只用于視網(wǎng)膜Shh、受體Smo、Ptc以及核轉(zhuǎn)錄因子Glil的免疫熒光或免疫熒光雙標(biāo)染色,正置熒光顯微鏡觀察呈現(xiàn)陽性熒光表達(dá)的細(xì)胞類型、數(shù)量及熒光強(qiáng)弱等；6只用于Western-blot方法定量檢測視網(wǎng)膜組織中上述四種蛋白的表達(dá)情況。余下6只大鼠視網(wǎng)膜用于實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescent quantitative reversetranscription polymerase chain reaction, Real-time PCR),定量分析高眼壓視網(wǎng)膜組織中Shh、Smo、Ptc和Glil的mRNA表達(dá)變化。Western-blot和Real-time PCR數(shù)據(jù)采用spss14.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)、方差齊性檢驗(yàn),描述性統(tǒng)計(jì)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(x±s)表示。兩組之間配對資料的t檢驗(yàn),組間差異比較用One-way ANOVA,P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果：免疫熒光雙標(biāo)顯示：對照組大鼠視網(wǎng)膜Shh主要在RGCs表達(dá),內(nèi)叢狀層也可見到弱陽性的表達(dá)；2w時(shí),高眼壓組在RGCs、內(nèi)叢狀層和外叢狀層都可以檢測到Shh表達(dá),熒光強(qiáng)度明顯增加。對照組Glil和Smo在RGCs的細(xì)胞質(zhì)中有弱陽性表達(dá),高眼壓組Glil陽性熒光信號同時(shí)出現(xiàn)在RGCs細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。Real-time PCR結(jié)果顯示1w、2w、4w高眼壓組ShhmRNA分別是對照組的2.6±0.7、4.4±0.9和2.1±0.5倍,各時(shí)間點(diǎn)同對照組相比,差異有顯著性(P0.01), Smo和Gli1mRNA表達(dá)量于成模后1w開始升高,并于2w時(shí)到達(dá)高峰,隨后又減少,與對照組相比,差異均有顯著性(P0.01)。Ptc的蛋白和mRNA表達(dá)量在高眼壓組和對照組未見明顯差異。Western-blot結(jié)果顯示高眼壓組在1w、2w和4w視網(wǎng)膜Shh蛋白分別是對照組的2.1±0.3、4.4±0.6和3.0±0.7倍(P0.01),并于2w時(shí)達(dá)到高峰。視網(wǎng)膜Smo和Glil蛋白表達(dá)量在1w時(shí)開始增高,2w時(shí)到達(dá)高峰,隨后下降。在1w、2w和4w時(shí),Smo蛋白表達(dá)分別是對照組的3.2±0.4倍(P0.05)、3.4±0.6倍(P0.01)和1.4±0.2倍(P0.05)；Glil蛋白表達(dá)量分別是對照組的1.6±0.1倍(P0.05)、2.5±0.3倍(P0.05)和2.0±0.5倍(P0.05)。 結(jié)論：大鼠慢性高眼壓動(dòng)物模型視網(wǎng)膜組織中Shh及Smo、Gli1表達(dá)水平升高,Glil在RGC中呈現(xiàn)核轉(zhuǎn)位表達(dá)。提示慢性高眼壓時(shí)視網(wǎng)膜Shh信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活,可能參與慢性高眼壓視網(wǎng)膜視神經(jīng)損傷修復(fù)的生理病理過程。 第三部分：Shh信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對大鼠慢性高眼壓RGCs損傷的作用及機(jī)制研究 目的：研究Shh信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對大鼠慢性高眼壓RGCs損傷的作用,并探討其可能分子機(jī)制。 方法：成年雄性SD大鼠以右眼結(jié)扎3條鞏膜上靜脈誘導(dǎo)高眼壓形成。按照玻璃體腔內(nèi)注射藥物或濃度的不同將大鼠隨機(jī)分為9組：不注射組、10μg/ml Shh-N組、50μg/ml Shh-N組、100μg/ml Shh-N組、1.0μg/ml cyclopamine (Shh阻滯劑)組、5.0μg/ml cyclopamine組、5.0μg/ml tomatidine組(與Cyclopamine有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu),但不能抑制Shh信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,)、0.1M磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline, PBS)組、和45%(W/V)2-羥丙基-環(huán)糊精(2-hydroxypropyl-cyclodextrin, HBC)組,注射體積均為2μl。每周重復(fù)注射一次。檢測時(shí)間點(diǎn)為玻璃體腔注射后1w、2w和4w。在動(dòng)物處死前5d,行DiI逆行標(biāo)記RGCs。制作全視網(wǎng)膜鋪片正置熒光顯微鏡觀察RGCs的存活及數(shù)量,并提取視網(wǎng)膜蛋白和總RNA行Western-blot和Real-time PCR檢測信號通路中各成分含量的變化。 結(jié)果：眼壓升高后2w和4w時(shí),玻璃體腔內(nèi)注射100μg/ml Shh-N組RGCs喪失率為分別為4.54±0.36%和9.67±0.31%,與PBS組(15.26±1.57%,22.58±1.97%)相比差異有顯著性(P0.01)；注射Shh-N50μg/ml RGCs喪失率分別為7.31±0.39%和12.67±0.29%,與PBS組(15.26±1.57%,22.58±1.97%)相比差異也有顯著性(P0.05);注射10μg/ml Shh-N組RGCs喪失率與PBS組相比無顯著性差異。玻璃體腔注射1.0μg/ml Cyclopamine組RGCs喪失率分別為19.29±0.43%(P0.05)和26.4±2.04%(P0.05),5.0μg/ml Cyclopamine組RGC喪失率分別為25.2±0.29%和30.7±0.31%,與HBC組相比差異均有顯著性(P0.01)。注射tomatidine組與注射PBS組相比,RGCs的喪失率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。HBC組與未注射組RGCs數(shù)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Shh對損傷RGC的保護(hù)作用及Cyclopamine的阻斷效應(yīng)均呈劑量相關(guān)性,高濃度組效果更加顯著。玻璃體腔注射Shh-N 2w后,Western Blot結(jié)果顯示高眼壓眼視網(wǎng)膜Smo和Glil蛋白表達(dá)量增加,Real-timePCR結(jié)果：Smo mRNA和Gli1 mRNA分別為對照組的1.52±0.16%倍和1.96±0.31%倍。注射Cyclopamine后,高眼壓眼Smo和Glil蛋白和mRNA表達(dá)量分別降低。 結(jié)論外源性和內(nèi)源性Shh都可以在高眼壓引起的RGCs損傷中發(fā)揮保護(hù)作用,并呈劑量相關(guān)性,以高濃度為顯著。Shh可能通過釋放Smo,激活轉(zhuǎn)錄因子Glil發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R775

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2323778