【摘要】：研究背景及目的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤是嬰幼兒最常見(jiàn)的眼內(nèi)惡性腫瘤。目前的治療方式有眼球摘除術(shù)及眼眶內(nèi)容摘出術(shù)、冷凝術(shù)、外部放射治療、鞏膜表面敷貼治療、經(jīng)瞳孔溫?zé)岑煼ā⒐鈩?dòng)力學(xué)治療等。近20年對(duì)RB的治療有長(zhǎng)足進(jìn)步,基因治療正處于研究階段。微泡造影劑可作為一種基因轉(zhuǎn)移載體,在聲像圖的監(jiān)控下進(jìn)行超聲輻照,微泡能夠在指定部位“爆破”,釋放所攜帶的基因。本文通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究超聲微泡造影劑攜帶RB94基因?qū)κ笠暰W(wǎng)膜母細(xì)胞瘤進(jìn)行轉(zhuǎn)染的效率及探討RB94基因?qū)κ笠暰W(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的作用效果。 第一部分視網(wǎng)膜下注射與玻璃體腔注射建立視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤動(dòng)物模型的比較 方法Rb細(xì)胞取HXO-Rb44細(xì)胞系,培養(yǎng)于含10%胎牛血清的改良型RPMI-1640培養(yǎng)基內(nèi),細(xì)胞懸液密度調(diào)至(5.0～6.0)×10~6/mL備用。30只裸鼠,分為視網(wǎng)膜下組和玻璃體腔組,每組各15只鼠30只眼。2組注射HXO-Rb44細(xì)胞懸液后每天裂隙燈下觀察裸鼠眼內(nèi)Rb腫物生長(zhǎng)情況,并于注射后21、28、35、42 d,根據(jù)組織病理學(xué)檢查統(tǒng)計(jì)成瘤情況,比較2組成瘤率。行Rb特異性標(biāo)志神經(jīng)元特異性烯醇酶(NSE)及酸性鈣結(jié)合蛋白(S100)和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)免疫組織化學(xué)檢測(cè)。 結(jié)果視網(wǎng)膜下組和玻璃體腔組在注射后均觀察到腫瘤在裸鼠眼內(nèi)生長(zhǎng)并逐漸增大。注射后21、28、35、42 d,視網(wǎng)膜下組成瘤率高于玻璃體腔組成瘤率,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。免疫組織化學(xué)染色提示,Rb細(xì)胞質(zhì)NSE表達(dá)較強(qiáng),S100表達(dá)較弱,GFAP表達(dá)最弱。 結(jié)論在同等條件下建立Rb動(dòng)物模型,視網(wǎng)膜下注射的成瘤率高于玻璃體腔內(nèi)注射者,且視網(wǎng)膜下注射建立的是原位腫瘤模型,生物學(xué)行為更接近臨床。 第二部分超聲微泡介導(dǎo)RB94基因轉(zhuǎn)染鼠視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤與傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染方法效率的比較 方法第二部分在第一部分實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,將32只BALB/C(nu/nu)裸鼠雙眼視網(wǎng)膜下接種HXO-Rb_(44)細(xì)胞,將造模成功的裸鼠隨機(jī)分為6組:①空白對(duì)照組;②空白微泡+超聲組;③RB94質(zhì)粒+微泡組;④RB94質(zhì)粒+脂質(zhì)體組;⑤空質(zhì)粒+微泡+超聲組;⑥RB94質(zhì)粒+微泡+超聲組。超聲組每天以0.5W/cm~2超聲波輻照眼球60s,工作時(shí)間控制為20%(即輻照4s,間隔24s,共用時(shí)間60s),轉(zhuǎn)染7天后,處死動(dòng)物,摘除眼球,用逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)RB94 mRNA表達(dá)。 結(jié)果RB94質(zhì)粒+微泡+超聲組和RB94質(zhì)粒+脂質(zhì)體組在治療7天后,腫瘤組織中RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳可明顯見(jiàn)到418bp條帶,其中RB94質(zhì)粒+微泡+超聲組表達(dá)較RB94質(zhì)粒+脂質(zhì)體組強(qiáng),二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 0.05)。 結(jié)論濃度適當(dāng)?shù)奈⑴菰趦?yōu)化的聲強(qiáng)條件下,可獲得RB94基因?qū)β闶笠暰W(wǎng)膜母細(xì)胞瘤較高的轉(zhuǎn)染效率。 第三部分RB94基因轉(zhuǎn)染后對(duì)鼠視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤生長(zhǎng)活性的影響 方法第三部分與第二部分同時(shí)進(jìn)行,將32只BALB/C(nu/nu)裸鼠雙眼視網(wǎng)膜下接種HXO-Rb_(44)細(xì)胞,將造模成功的裸鼠隨機(jī)分為6組:分組及轉(zhuǎn)染方法同第二部分,用Western-blot法檢測(cè)各組腫瘤組織VEGF、MICA、MICB表達(dá)情況。 結(jié)果RB94質(zhì)粒+脂質(zhì)體組和RB94質(zhì)粒+微泡+超聲組VEGF蛋白表達(dá)明顯低于其他四組,而這兩組中RB94質(zhì)粒+微泡+超聲組VEGF蛋白表達(dá)最低,二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。RB94質(zhì)粒+脂質(zhì)體組和RB94質(zhì)粒+微泡+超聲組MICA和MICB蛋白表達(dá)明顯高于其他四組,而這兩組中RB94質(zhì)粒+微泡+超聲組表達(dá)更高,二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),但總體上各組MICB的表達(dá)要弱于MICA。 結(jié)論RB94質(zhì)粒+微泡+超聲組能顯著抑制腫瘤組織中VEGF的表達(dá),VEGF的活性被抑制能減緩腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。RB94質(zhì)粒+微泡+超聲組能上調(diào)MICA及MICB的表達(dá),一定程度上能增強(qiáng)NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性從而抑制腫瘤組織生長(zhǎng)。上述結(jié)果反應(yīng)出RB94基因?qū)β闶笠暰W(wǎng)膜母細(xì)胞瘤具有較明顯的抑制作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R739.7

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本文編號(hào)：2323669