【摘要】： 隨著準分子激光角膜屈光手術的發(fā)展,角膜表面切削術因為不存在角膜瓣相關并發(fā)癥,擴大了近視手術的矯治范圍以及術后成像質量高等優(yōu)勢而重新受到關注。然而,角膜上皮下霧狀混濁(Haze)的發(fā)生是制約角膜表面屈光手術的一個重要因素。Haze是準分子激光角膜表面切削術后一定時間在角膜切削區(qū)出現(xiàn)的上皮及其下方基質的霧狀混濁,是準分子激光角膜表面切削術后的主要并發(fā)癥之一。不同的角膜表面切削方式術后Haze的發(fā)生率也不同。Haze不僅影響視力,還是造成屈光回退的主要原因。Haze的形成是一個復雜的角膜創(chuàng)傷愈合反應過程,由多種細胞和因子參與調控,是多種因素共同作用的結果。近年來,角膜表面屈光手術后Haze形成的機制及防治已成為屈光手術研究的熱點。本研究通過建立機械法準分子激光上皮瓣下角膜磨鑲術(Epi-LASIK)、去瓣的Epi-LASIK(off-flap Epi-LASIK)和準分子激光屈光性角膜切削術(PRK)動物模型,旨在從病理組織學角度和分子生物學水平,比較不同方式的準分子激光角膜表面切削術后角膜創(chuàng)傷的愈合反應和Haze產(chǎn)生的差異,來探討Haze形成的機制,為臨床上準分子激光治療屈光不正的術式選擇和Haze的防治提供理論依據(jù)。 第一部分兔Epi-LASIK、去瓣的Epi-LASIK和PRK術后早期角膜創(chuàng)傷愈合反應的對比研究 目的:通過比較兔Epi-LASIK , off-flap Epi-LASIK and PRK三種角膜表面切削術,探討不同的手術方式及術后不同的角膜上皮愈合方式對早期角膜創(chuàng)傷愈合反應的影響。 方法:健康新西蘭白兔共50只(100只眼),將其中48只(96只眼)隨機分為Epi-LASIK , off-flap Epi-LASIK and PRK三個手術組,每組32只眼,另2只兔(4只眼)未手術眼作為正常對照組。3%戊巴比妥鈉耳緣靜脈麻醉(1ml/kg體重)和0.5%愛爾卡因表面麻醉后,實驗眼分別行Epi-LASIK、off-flap Epi-LASIK和PRK三種角膜表面切削術,且每只兔的兩只眼分別隨機行不同的手術方式。Epi-LASIK術應用微型角膜上皮刀制作角膜上皮瓣,準分子激光切削后再將上皮瓣復位,覆蓋在切削區(qū)上;off-flap Epi-LASIK術是用微型角膜上皮刀制作角膜上皮瓣,完成激光切削后,再將上皮瓣去除;PRK術用角膜上皮刮刀鈍性機械去除角膜上皮,去除角膜上皮的直徑為9.0mm,將上皮刮除干凈后行激光切削。采用美國博士倫公司Technolas217型準分子激光治療儀在實驗眼均行-10.0D激光切削,切削深度120μm。分別在術后4小時、1天、3天和7天共四個時間點處死各組動物,取角膜進行如下實驗觀察:1.采用光鏡、透射電子顯微鏡觀察三種手術后角膜上皮的愈合方式。2.免疫組織化學方法檢測角膜基質炎癥細胞數(shù)量、角膜基質細胞凋亡數(shù)量以及白細胞介素-1(IL-1β)和增殖蛋白Ki-67在角膜基質的表達。 結果:1我們通過光鏡和透射電鏡觀察到三種手術術后角膜上皮的愈合方式有不同的特點:(1)Epi-LASIK術后4小時上皮大部分表層細胞水腫,有輕微損傷的表現(xiàn),上皮與基質結合稍疏松;術后1天上皮瓣稍變薄,上皮表面微絨毛減少,小部分基底細胞水腫,提示上皮瓣活性尚可;術后3天可見上皮瓣水腫;術后7天上皮水腫消退,基本恢復正常結構,但上皮層數(shù)較前增多,約7-9層,上皮表面微絨毛正常。(2)off-flap Epi-LASIK術后4小時,角膜切削區(qū)基質表面無上皮;術后1天,有一層新生角膜上皮細胞覆蓋切削區(qū),以后新生的角膜上皮逐層增多,術后7天上皮層數(shù)約7-8層,結構恢復正常。(3)PRK組術后4小時,角膜切削區(qū)無上皮;術后1天,角膜切削區(qū)邊緣可見單層上皮細胞向切削區(qū)延伸,切削區(qū)仍暴露部分裸露的基質床,以后新生的上皮逐漸覆蓋切削區(qū),層數(shù)增多,但上皮細胞排列較紊亂,術后7天,上皮約5-7層,上皮細胞排列稍紊亂,基底膜完整,上皮表面可見少量微絨毛。2角膜的愈合反應:(1)Epi-LASIKPRK、off-flap Epi-LASIK和PRK三種角膜表面切削術后4小時角膜淺基質層即可見炎性細胞浸潤、凋亡的陽性細胞以及IL-1β和增殖蛋白Ki-67的表達;三組手術后1天角膜基質的炎性細胞數(shù)量和凋亡的細胞均最多,增殖蛋白Ki-67的表達均在術后3天達到高峰。(2)術后7天,Epi-LASIK和off-flap Epi-LASIK組未見炎性細胞,PRK組偶見炎性細胞,三組角膜基質中均僅有少量TUNEL陽性細胞,IL-1β和Ki-67的表達均開始降低。(3)PRK組術后4小時、1天、3天和7天四個時間點上述各項指標均顯著高于Epi-LASIK和off-flap Epi-LASIK組,組間兩兩比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05);而Epi-LASIK組術后各時間點的炎性細胞數(shù)、凋亡的陽性細胞數(shù)以及IL-1β和增殖蛋白Ki-67的表達又均比off-flap Epi-LASIK組多,其中炎性細胞數(shù)和凋亡的陽性細胞數(shù)于術后1天和3天組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05),IL-1β和Ki-67的表達在術后1天、3天和7天組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 結論:Epi-LASIK、off-flap Epi-LASIK和PRK三種角膜表面切削術由于術中不同的上皮處理方式及術后不同的上皮愈合方式引起術后早期角膜創(chuàng)傷愈合反應程度的差異,其中off-flap Epi-LASIK的反應程度最輕,提示off-flap Epi-LASIK可能在減輕角膜表面切削術的術后早期刺激癥狀和遠期Haze發(fā)生率方面具有一定的優(yōu)勢。 第二部分兔Epi-LASIK、去瓣的Epi-LASIK和PRK術后Haze形成的對比研究 目的:探討Epi-LASIK , off-flap Epi-LASIK and PRK三種角膜表面切削術后在Haze發(fā)生發(fā)展方面存在的差異及成因。 方法:健康新西蘭白兔共47只(94只眼),將其中45只(90只眼)隨機分為Epi-LASIK , off-flap Epi-LASIK and PRK三個手術組,每組30只眼,另2只兔(4只眼)未手術眼作為正常對照組。3%戊巴比妥鈉耳緣靜脈麻醉(1ml/kg體重)和0.5%愛爾卡因表面麻醉后,實驗眼分別行Epi-LASIK、off-flap Epi-LASIK和PRK三種角膜表面切削術,且每只兔的兩只眼分別隨機行不同的手術方式。Epi-LASIK術應用微型角膜上皮刀制作角膜上皮瓣,準分子激光切削后再將上皮瓣復位,覆蓋在切削區(qū)上;off-flap Epi-LASIK術是用微型角膜上皮刀制作角膜上皮瓣,完成激光切削后,再將上皮瓣去除;PRK術用角膜上皮刮刀鈍性機械去除角膜上皮,去除角膜上皮的直徑為9.0mm,將上皮刮除干凈后行激光切削。采用美國博士倫公司Technolas217型準分子激光治療儀在實驗眼均行-10.0D激光切削,切削深度120μm。三種角膜表面切削術后,進行如下實驗觀察:1、定期在裂隙燈顯微鏡下觀察角膜上皮的愈合情況并記錄每個手術組兔角膜上皮的愈合時間及進行Haze的分級評估。2、分別于術后1周、1個月和3個月共三個時間點處死各組動物,取角膜。通過透射電鏡對兔術后不同時間點角膜的組織結構進行觀察;采用免疫組織化學、免疫印跡法(Western Blot法)等檢測方法測定與Haze形成密切相關的指標α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和Ⅲ型膠原在角膜中的表達。 結果: 1角膜上皮愈合時間:Epi-LASIK、off-flap Epi-LASIK和PRK術后兔眼平均角膜上皮愈合時間分別為4.1±1.0,3.8±0.8和4.4±1.2天,三個手術組組間兩兩比較差異均無統(tǒng)計學意義(F=0.88,P0.05)。2角膜Haze情況:(1)術后1個月,Epi-LASIK組Haze的發(fā)生率為40%(0.5級Haze 6眼,1級Haze 2眼);off-flap Epi-LASIK組為35%(0.5級Haze 5眼,1級Haze 2眼);PRK組為80%(0.5級Haze 8眼,1級Haze 5眼)。PRK與Epi-LASIK和off-flap Epi-LASIK兩組比較差異均有統(tǒng)計學意義(p0.05);Epi-LASIK和off-flap Epi-LASIK兩組間比較差異沒有統(tǒng)計學意義(p0.05)。(2)術后3個月,Epi-LASIK組Haze的發(fā)生率為30%(0.5級Haze 3眼);off-flap Epi-LASIK組為30%(0.5級Haze 2眼,1級Haze 1眼);PRK組為60%(0.5級Haze 4眼,1級Haze 2眼)。三組間兩兩比較差異均無統(tǒng)計學意義(p0.05)。3、透射電子顯微鏡觀察:(1)術后1個月,Epi-LASIK,off-flap Epi-LASIK和PRK三組角膜上皮的結構基本正常,角膜淺基質成纖維細胞明顯增多、形態(tài)和排列不規(guī)則、細胞核變大、核仁明顯、常染色質和粗面內質網(wǎng)豐富,新陳代謝旺盛,新生的膠原明顯增多且排列紊亂。三組中PRK的程度較重,Epi-LASIK與off-flap Epi-LASIK兩組比較未發(fā)現(xiàn)明顯差異。(2)術后3個月,三個手術組角膜淺基質內成纖維細胞數(shù)量均開始減少、形態(tài)及排列較前規(guī)則,膠原排列仍稍紊亂,PRK組的程度比Epi-LASIK和off-flap Epi-LASIK兩組稍重,且膠原纖維較粗大。4、免疫組織化學及免疫印跡法檢測角膜中α-SMA的表達:Epi-LASIK、off-flap Epi-LASIK和PRK三組術后1周角膜中α-SMA的表達開始增多,術后1個月角膜α-SMA的表達均達到高峰。三組術后在1周、1個月和3個月角膜中α-SMA的表達均為PRKEpi-LASIK off-flap Epi-LASIK,三組與對照組以及三個時間點的組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(p0.05)。5、免疫組織化學及免疫印跡法檢測角膜中Ⅲ型膠原的表達:Epi-LASIK、off-flap Epi-LASIK和PRK三組術后1周角膜中Ⅲ型膠原的表達明顯增多,并均于術后1個月達到高峰,三組術后在1周、1個月和3個月角膜中Ⅲ型膠原的表達均為PRKEpi-LASIKoff-flap Epi-LASIK,三組與對照組以及三個時間點的組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(p0.05)。 結論:Epi-LASIK手術中上皮瓣的保留對促進術后角膜上皮的愈合、減少Haze形成沒有明顯的意義,角膜表面切削術中盡量減少對角膜上皮的損傷,是防治術后Haze形成的關鍵因素。off-flap Epi-LASIK與Epi-LASIK和PRK比較,術后角膜上皮愈合快、Haze反應輕,有望成為臨床上優(yōu)先選擇的角膜表面屈光手術方式。 第三部分兔Epi-LASIK、去瓣的Epi-LASIK和PRK術后角膜中TGF-β1和CTGF的表達及其對Haze形成的影響 目的:通過觀察Epi-LASIK、off-flap Epi-LASIK和PRK三種角膜表面切削術后角膜中轉化生長因子-β1(TGF-β1)和結締組織生長因子(CTGF)的表達情況,探討兩者之間的關系及其對術后Haze發(fā)生發(fā)展的影響。 方法:健康新西蘭白兔共47只(94只眼),將其中45只(90只眼)隨機分為Epi-LASIK , off-flap Epi-LASIK and PRK三個手術組,每組30只眼,另2只兔(4只眼)未手術眼作為正常對照組。3%戊巴比妥鈉耳緣靜脈麻醉(1ml/kg體重)和0.5%愛爾卡因表面麻醉后,實驗眼分別行Epi-LASIK、off-flap Epi-LASIK和PRK三種角膜表面切削術,且每只兔的兩只眼分別隨機行不同的手術方式。采用美國博士倫公司Technolas217型準分子激光治療儀在實驗眼均行-10.0D激光切削,切削深度120μm。分別于術后1周、1個月和3個月共三個時間點處死各組動物取角膜,采用免疫組織化學和免疫印跡法(Western Blot法)檢測Haze形成過程中的兩個主要調控因子TGF-β1和CTGF在三種手術后角膜中的表達情況。 結果:1免疫組織化學及免疫印跡法檢測角膜中TGF-β1的表達:正常對照組角膜中TGF-β1的表達非常低弱。Epi-LASIK、off-flap Epi-LASIK和PRK術后1周TGF-β1的表達明顯增強,術后1個月達高峰,術后3個月仍有較強表達,其中PRK組在術后1周、1個月和3個月三個時間點TGF-β1的表達均明顯高于Epi-LASIK和off-flap Epi-LASIK組,Epi-LASIK組又稍高于off-flap Epi-LASIK組,三組與對照組以及三個時間點的組間兩兩比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。2免疫組織化學及免疫印跡法檢測角膜中CTGF的表達:Epi-LASIK、off-flap Epi-LASIK和PRK術后1周CTGF的表達開始升高,均在術后1個月表達最強,術后3個月仍有較高表達,其中PRK組在術后1周、1個月和3個月三個時間點CTGF的表達均明顯高于Epi-LASIK和off-flap Epi-LASIK組,差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05);Epi-LASIK組在術后三個時間點CTGF的表達又稍高于off-flap Epi-LASIK組,術后1周兩組比較差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),術后1個月、3個月比較差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);三組與對照組比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 結論:TGF-β1和CTGF介導了角膜表面切削術后角膜創(chuàng)傷的愈合反應,在愈合反應過程中具有協(xié)同作用,與Haze的發(fā)生發(fā)展關系密切。off-flap Epi-LASIK術后各時間點角膜中TGF-β1和CTGF的表達明顯低于Epi-LASIK和PRK,差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05),提示off-flap Epi-LASIK在減少術后Haze形成方面較Epi-LASIK,特別是PRK具有明顯優(yōu)勢。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R779.63

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本文編號：2304108