【摘要】：論文一單純性先天性白內(nèi)障的分子遺傳學(xué)研究 先天性白內(nèi)障是指在孕期或胎兒期由于各種因素使晶狀體發(fā)育受到影響,導(dǎo)致出生時(shí)或出生一年以內(nèi)出現(xiàn)不同程度的晶狀體渾濁,是兒童致盲的首要原因之一。大約1/3的先天性白內(nèi)障與遺傳有關(guān),臨床表現(xiàn)可為單純眼部異常,也可作為某些綜合征的表型之一,具有明顯的臨床異質(zhì)性和遺傳異質(zhì)性。常見的遺傳方式有常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳和性染色體連鎖遺傳,其中以常染色體顯性遺傳最為多見。 第一部分三個(gè)先天性白內(nèi)障家系的致病突變研究 本研究小組的前期工作通過微衛(wèi)星標(biāo)記的兩點(diǎn)連鎖分析,將一個(gè)中國漢族單純性先天性后極性白內(nèi)障家系的致病區(qū)域鎖定在染色體1p36,這與1997年報(bào)道的英國先天性后極性白內(nèi)障家系和2005年報(bào)道的澳大利亞先天性全白內(nèi)障家系的定位區(qū)域一致,后兩個(gè)研究小組自定位后尚未確定致病基因。結(jié)合澳大利亞家系的連鎖范圍,我國家系最終精細(xì)定位于微衛(wèi)星標(biāo)記D1S436與D1S199之間大約4Mb的范圍內(nèi)。 本文第一部分以上述中國(家系1)、英國(家系2)和澳大利亞(家系3)家系作為研究對象。首先在家系1對定位區(qū)域內(nèi)6個(gè)候選基因進(jìn)行突變篩查。結(jié)果在EPHA2基因第16外顯子內(nèi)檢測到一個(gè)錯(cuò)義突變,c.2819CT,使編碼蛋白第940位蘇氨酸變?yōu)楫惲涟彼?p.T940I)。對家系1所有成員以及202個(gè)無關(guān)健康個(gè)體進(jìn)行酶切驗(yàn)證,結(jié)果表明所有患者均攜帶該突變,突變與疾病表型共分離。隨后對家系2和家系3中患者EPHA2基因進(jìn)行突變篩查。結(jié)果在家系2第17外顯子發(fā)現(xiàn)一個(gè)缺失突變,c.2915_2916de1TG,使編碼蛋白自第972位發(fā)生氨基酸改變,產(chǎn)生39個(gè)新的氨基酸。在家系3第16內(nèi)含子檢測到單個(gè)核苷酸改變,c.2826-9GA。使用Minigene檢測法證實(shí)該突變可使剪接位點(diǎn)發(fā)生改變,導(dǎo)致7個(gè)核苷酸的插入,使編碼蛋白自第943位發(fā)生氨基酸改變,產(chǎn)生71個(gè)新的氨基酸。這是國際首次將EPHA2確定為先天性白內(nèi)障的致病基因,也是首次將Eph家族與單基因遺傳病聯(lián)系起來。為方便描述,將攜帶p.T940I.c.2915_2916delTG和c.2826-9GA的突變型蛋白分別簡稱為T940I、C39和C71。 EPHA2是Eph受體家族的一員,廣泛表達(dá)于上皮來源的細(xì)胞。在ephrinA配體的激活作用下,參與細(xì)胞遷移和凋亡等過程,在胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生中起到重要的調(diào)控作用。為了進(jìn)一步研究EPHA2基因突變導(dǎo)致先天性白內(nèi)障的分子機(jī)制,我們首先通過RT-PCR在人類晶狀體組織和培養(yǎng)的人類晶狀體上皮細(xì)胞對EPHA2的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行鑒定,并結(jié)合BALB/C小鼠晶狀體免疫組化染色,明確了EPHA2在晶狀體上皮細(xì)胞中的表達(dá)。 隨后我們對外源表達(dá)野生型與突變型EPHA2后,晶狀體上皮細(xì)胞的遷移和凋亡進(jìn)行檢測。發(fā)現(xiàn)三種突變型蛋白與野生型相比對晶狀體上皮細(xì)胞的遷移和凋亡均沒有顯著影響,推測上述突變可能導(dǎo)致編碼蛋白功能的缺失,以致于無法通過外源轉(zhuǎn)染的方法檢測到突變型蛋白的獲得功能效應(yīng)。此外我們發(fā)現(xiàn),外源轉(zhuǎn)染后三種突變體的蛋白水平均明顯低于野生型,并且在使用MG132抑制蛋白酶體降解途徑后,突變型的蛋白水平明顯回升。提示突變型蛋白易于發(fā)生降解這樣一種“缺失功能效應(yīng)”可能是三種突變導(dǎo)致先天型白內(nèi)障的共同機(jī)制之一。 已有研究表明,ephrinA配體結(jié)合后,EPHA2受體寡聚并發(fā)生自我交互磷酸化,受體的寡聚是其磷酸化的必要條件,而磷酸化的受體容易被內(nèi)吞并通過蛋白酶體途徑降解。SHIP2和LMW-PTP可以結(jié)合至磷酸化受體C末端的結(jié)構(gòu)域參與維持其穩(wěn)定。我們通過酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),T940I對SHIP2的結(jié)合力減弱,而C39和C71與自身的相互作用增強(qiáng),提示三種突變型蛋白可能通過不同的機(jī)制發(fā)生降解。此外,酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)中,C39和C71對野生型EPHA2以及LMW-PTP的結(jié)合力明顯增強(qiáng),提示突變型蛋白存在“顯性負(fù)效應(yīng)”和“獲得功能效應(yīng)”也是先天性白內(nèi)障的發(fā)生機(jī)制之一。 第二部分一個(gè)先天性全白內(nèi)障四胞胎家系致病基因的定位研究 本文第二部分以一個(gè)中國漢族先天性全白內(nèi)障家系作為研究對象。家系兩代7人,第二代5人(Ⅱ1-Ⅱ5)中個(gè)體Ⅱ-Ⅱ5為異卵四胞胎,其中Ⅱ2、Ⅱ4和Ⅱ5為患者。在排除了宮內(nèi)感染風(fēng)疹病毒導(dǎo)致先天性白內(nèi)障的可能性后,我們通過微衛(wèi)星標(biāo)記的兩點(diǎn)連鎖分析,在排除了40個(gè)已知基因座和9個(gè)自選基因座的致病性后,發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的可能致病區(qū)域,染色體6q15-qter。在該區(qū)域內(nèi)選擇GJA1、GJA10、HSF2、COL10A1、SLC35F1、SLC22A16、SLC2A12、SAMD3、PRDM1、EPHA7、FYN、 FOXO3、SNX和WASFl作為候選基因進(jìn)行直接測序,并最終排除了這14個(gè)基因。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R776.1

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本文編號：2291493