【摘要】： 第一部分： Toll樣受體4信號通路介導(dǎo)的人角膜細胞對棘阿米巴的炎性反應(yīng) 目的研究Toll樣受體(Toll-like receptors, TLR)信號通路在人永生化角膜上皮細胞(HUCLs)和基質(zhì)細胞(THSFs)對棘阿米巴的炎性反應(yīng)中的作用。 方法培養(yǎng)永生化的人角膜上皮細胞(Telomerase-immortalized human epithelial cells, HUCLs)、角膜基質(zhì)細胞(Telomerase-immortalized human stromal fibroblasts, THSFs),和棘阿米巴蟲株。用一定濃度的棘阿米巴刺激兩組HUCLs,刺激后的不同時間點收集細胞,Real Time-PCR檢測TLR1-10mRNA、通路分子髓分化因子88 (Myeloid differentiation factor 88, MyD88)、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellularregulatedproteinkinases,ERK)、核轉(zhuǎn)錄因子NF-kB (nuclear transcription factor-KB, NF-kB)、c-jun氮端激酶(c-jun N-terminal kinase, JNK)、p38mRNA的表達,篩選出受棘阿米巴刺激后表達發(fā)生變化的受體(TLR2,TLR4, TLR5)以及通路分子ERK和NF-kB, Western blot和免疫熒光檢測TLR2、TLR4、TLR5、p-ERK、p-IkB的蛋白表達,酶聯(lián)免疫吸附實驗(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)檢測炎性細胞因子白介素(interleukin, IL-8,腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α,和干擾素(interferon, IFN)-β的水平變化。用TLR2, TLR4, TLR5對應(yīng)中和抗體單獨或聯(lián)合應(yīng)用預(yù)處理細胞后進行刺激并檢測細胞因子的表達變化情況,分析起主要作用的受體。單獨或聯(lián)合應(yīng)用特異性的通路抑制劑四氫吡咯二硫代氨基甲酸酯(pyrrolidine dithiocarbamate, PDTC)或／和U0126 (1,4-Diamino- 2,3-dicyano- 1,4-bis (o-aminophenylmercapto) butadiene)預(yù)處理細胞,特異性封閉NF-kB通路或／和ERK通路后,用棘阿米巴刺激細胞并檢測炎性細胞因子的表達變化情況,分析參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的信號通路。 結(jié)果①TLR1-10篩選實驗：HUCLs和THSFs受棘阿米巴刺激后,在被檢測的10種Toll樣受體中,TLR2, TLR4, TLR5mRNA表達以時間依賴方式呈現(xiàn)先增高后降低,其余幾種TLR受體表達水平無變化。TLR4在mRNA和蛋白水平的表達均顯著增高。TLR2在mRNA水平表達增高,在蛋白水平表達輕度增高。TLR5 mRNA表達略有升高,蛋白水平無明顯變化。②LRs信號通路活化實驗：棘阿米巴刺激HUCLs和THSFs后,通路分子MyD88、ERK、NF-kB、在mRNA和蛋白水平表達均明顯增高,檢測的細胞因子IL-8和TNF-α在細胞刺激后早期分泌增到,炎癥反應(yīng)中后期IFN-β分泌增多。③抗體封閉實驗：單純抗TLR4中和抗體預(yù)處理HUCLs和THSFs時,兩種細胞分泌IL-8, TNF-α, IFN-β水平均明顯下降。單純TLR2或TLR5中和抗體預(yù)處理細胞時,細胞因子表達水平無明顯增減,聯(lián)合應(yīng)用抗體預(yù)處理細胞時,僅在應(yīng)用TLR4的條件下,細胞因子表達水平降低。④通路封閉實驗：NF-kB特異性通路抑制劑PDTC預(yù)處理HUCLs和THSFs后,細胞因子IL-8和TNF-α的分泌水平降低,ERK通路特異性抑制劑U0126預(yù)處理HUCLs和THSFs后,細胞因子IFN-β的分泌降低。 結(jié)論TLR4參與了HUCLs和THSFs對棘阿米巴的識別,在細胞受刺激后早期通過TLR4-MyD88-NF-kB通路誘導(dǎo)下游炎性細胞因子IL-8和TNF-a的產(chǎn)生,并在炎癥反應(yīng)中后期通過TLR4-ERK通路誘導(dǎo)下游炎性細胞因子IFN-β,介導(dǎo)角膜細胞的炎性反應(yīng)。 第二部分： 棘阿米巴角膜炎模型的建立及TLR4信號通路的體內(nèi)作用研究 目的應(yīng)用三種不同方法建立棘阿米巴角膜炎的大鼠和小鼠模型,分析各種方法的優(yōu)缺點和適用范圍,并研究Toll樣受體4信號通路在棘阿米巴角膜炎的Wistar大鼠模型中的作用。 方法Wistar大鼠和昆明小鼠各45只,隨機分為A、B、C組,每組15只。分別采用角膜劃傷-棘阿米巴刺激-瞼裂縫合法(A組),角膜劃傷-接觸鏡片覆蓋方法(B組),基質(zhì)層內(nèi)注射棘阿米巴懸液方法(C組)建立模型。每組取5只,在刺激后不同時間點取角膜,行角膜切片HE染色尋找棘阿米巴滋養(yǎng)體和包囊。剩余每組10只,分別用裂隙燈觀察、10%KOH濕封片法、角膜刮除物培養(yǎng)法、炎癥程度分級等方法分析各組動物模型成功率、炎癥的嚴重程度。角膜劃傷-棘阿米巴刺激法建立棘阿米巴角膜炎的Wistar大鼠模型,模型建立后1,3,7,13,21天處死大鼠并收集角膜,以實時定量PCR方法檢測大鼠角膜組織中TLR2、TLR4、核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor, NF)-kB,胞外信號調(diào)控激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK),白介素(interleukin, ID-8,腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α,和干擾素(interferon, IFN)-β等分子的mRNA表達水平。Western blot及免疫熒光組織化學(xué)檢測TLR2、TLR4、p-Erkl/2,和p-IkB蛋白質(zhì)的表達。單獨或聯(lián)合應(yīng)用特異性的通路抑制劑PDTC或／和U0126預(yù)處理大鼠,特異性封閉NF-kB通路或／和ERK通路后,建立棘阿米巴角膜炎的大鼠模型,并檢測炎性細胞因子的表達變化情況,分析參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的信號通路。 結(jié)果A組中,有4只大鼠、6只小鼠發(fā)生炎癥反應(yīng),B組中,有7只大鼠和8只小鼠發(fā)生炎癥反應(yīng),C組中,有10只大鼠和10只小鼠產(chǎn)生角膜炎癥反應(yīng)。所有發(fā)生炎癥的動物經(jīng)各種方法均證實僅為棘阿米巴感染,無其它合并感染。其中A組和B組動物表現(xiàn)出典型的棘阿米巴角膜炎的病理和臨床病程,C組能夠更快的建立棘阿米巴角膜炎的模型,迅速形成角膜環(huán)形潰瘍、基質(zhì)膿腫等,但不能模擬正常人體感染過程。在棘阿米巴角膜炎的Wistar大鼠模型的角膜組織中,TLR4,通路分子NF-kB, p-IkB和p-Erk1/2,以及細胞因子IL-8, TNF-α, IFN-β表達水平均明顯增高。PDTC預(yù)處理組大鼠角膜組織中的炎性細胞因子IL-8和TNF-α水平明顯降低,U0126預(yù)處理組大鼠角膜組織中炎性細胞因子IFN-β表達水平明顯降低。 結(jié)論基質(zhì)層內(nèi)注射法能夠更有效的建立鼠的棘阿米巴角膜炎模型。角膜劃傷-眼瞼縫合法在大小鼠中成功率均較低,但較好的模擬了角膜自然感染過程。角膜劃傷-角膜接觸鏡覆蓋法效果介于上述兩者之間,較好模擬了因佩戴接觸鏡導(dǎo)致的角膜感染過程。TLR4在Wistar大鼠體內(nèi)參與識別棘阿米巴入侵角膜的過程,并分別通過TLR4-NF-kB和TLR4-Erk1/2誘導(dǎo)炎性細胞因子IL-8, TNF-α,和IFN-β的合成。 第三部分： 甘露糖在棘阿米巴誘導(dǎo)角膜上皮細胞激活TLR4信號通路過程中的作用 目的探討甘露糖在棘阿米巴誘導(dǎo)角膜上皮細胞激活Toll樣受體4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路過程中的作用。 方法培養(yǎng)永生化的人類角膜上皮細胞(Telomerase-immortalized human corneal epithelial cells HUCLs)和棘阿米巴蟲株,在甘露糖存在或缺失的條件下,用一定濃度的棘阿米巴刺激HUCLs,刺激后4小時收集細胞,Real Time-PCR檢測TLR4以及通路分子NF-kB、Erk1/2在mRNA水平的表達,Western blot和免疫熒光方法檢測TLR4以及磷酸化的通路分子p-IkB、p-Erk1/2的表達,ELISA檢測炎性細胞因子IL-8, TNF-α, IFN-β的水平變化。用細胞通路抑制劑PDTC和／或U0126預(yù)處理HUCLs,在甘露糖存在或缺失的條件下,重復(fù)棘阿米巴刺激過程,ELISA方法檢測炎性細胞因子TNF-α, IL-8, IFN-β的水平變化。 結(jié)果HUCLs受棘阿米巴刺激后,TLR4表達明顯升高。通路分子NF-k B, p-IkB、p-Erk1/2以及炎性細胞因子TNF-α、IL-8和IFN-βmRNA表達增高。甘露糖預(yù)處理組TLR4、通路分子及炎性細胞因子表達水平高于正常細胞組,低于無甘露糖處理組。通路抑制實驗顯示,PDTC預(yù)處理組炎性細胞因子TNF-α和IL-8的表達降低,U0126可降低IFN-β的表達。相比未加甘露糖預(yù)處理的細胞組,甘露糖預(yù)處理組加入通路抑制劑后,炎性細胞因子表達降低更明顯。 結(jié)論：甘露糖可部分抑制棘阿米巴對TLR4信號通路的激活,從而抑制其誘導(dǎo)的炎性細胞因子的合成。甘露糖與TLR通路抑制劑同時作用,可顯著抑制棘阿米巴誘導(dǎo)的炎性細胞因子合成。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R772.21

【參考文獻】

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本文編號：2280428