發(fā)布時(shí)間：2018-10-05 20:57

【摘要】：目的和意義 鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是我國(guó)南方及東南亞地區(qū)常見(jiàn)的一種惡性腫瘤,其發(fā)病與愛(ài)波斯坦-巴爾病毒(Epstein Barr Virus, EBV)感染、化學(xué)促癌物和/或致癌物以及遺傳因素密切相關(guān),但迄今為止,鼻咽癌發(fā)病的分子機(jī)制尚未完全闡明。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn),鼻咽癌的發(fā)病具有民族、地域和家族聚集現(xiàn)象,其患者在3號(hào)染色體短臂最常發(fā)生連續(xù)性、非隨機(jī)性等位基因雜合子缺失(loss of heterozygosity, LOH),其中3p14～21、3p21.3～22和3p25-26是原發(fā)性鼻咽癌LOH高頻區(qū),且3號(hào)染色體短臂的遺傳學(xué)改變常發(fā)生在鼻咽部上皮細(xì)胞表型發(fā)生異常和EBV感染之前,是鼻咽癌發(fā)生過(guò)程中的極早期事件。因此,在3號(hào)染色體短臂尋找鼻咽癌相關(guān)的未知基因?qū)τ诮沂颈茄拾┌┳冊(cè)缙诘姆肿訖C(jī)制具有重要的意義。 MicroRNA (miRNA)是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)大小約為19～25個(gè)核苷酸(nucleotide, nt)的非編碼單鏈小分子RNA,由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的大小約為70～100nt的單鏈RNA前體(pre-miRNA)經(jīng)過(guò)Dicer酶剪切加工后生成,通過(guò)與靶基因mRNA的3,非編碼區(qū)(3'untranslated region,3'UTR)互補(bǔ)匹配導(dǎo)致該mRNA的降解。大多數(shù)miRNA與底物mRNA不完全配對(duì)結(jié)合,通過(guò)轉(zhuǎn)錄后抑制翻譯來(lái)調(diào)控基因表達(dá)。miRNA基因以單拷貝、多拷貝或基因簇等多種形式存在于基因組中,而且絕大部分定位于基因間隔區(qū),其轉(zhuǎn)錄獨(dú)立于其他基因,并不翻譯成蛋白質(zhì),而是在體內(nèi)代謝過(guò)程中發(fā)揮多種調(diào)控作用,包括動(dòng)植物的組織器官發(fā)育、細(xì)胞分化和凋亡、胰島素分泌、脂肪代謝等多種生命活動(dòng),其表達(dá)失調(diào)將導(dǎo)致重大疾病,如腫瘤的發(fā)生。 正常細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、發(fā)育、分化和死亡是一個(gè)高度有序的過(guò)程,而腫瘤的形成正是這一高度有序的過(guò)程發(fā)生紊亂所造成的,其發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多步驟、多階段、多因素參與的復(fù)雜過(guò)程,這一過(guò)程涉及到多個(gè)基因在時(shí)間和空間上的協(xié)調(diào)表達(dá)。除了蛋白編碼基因,最近研究發(fā)現(xiàn)miRNA在腫瘤的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮舉足輕重的作用。miRNA作為一類(lèi)新型基因調(diào)控劑,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。有研究表明,50%以上的miRNA定位在腫瘤相關(guān)的基因組區(qū)域,包括LOH區(qū)、染色體擴(kuò)增區(qū)及脆性位點(diǎn)等,其表達(dá)水平在多種腫瘤中發(fā)生改變,通過(guò)調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯,影響癌細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、運(yùn)動(dòng)、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移以及血管生成等生物學(xué)特性,發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用,多角度多層次的參與了腫瘤的演進(jìn)。 miR-26a首先從Hela細(xì)胞克隆得到,全長(zhǎng)22nt,在多種組織泛表達(dá),其表達(dá)無(wú)組織特異性。值得注意的是,miR-26a定位在3p22,此區(qū)域恰好為鼻咽癌LOH高頻區(qū),也是克隆鼻咽癌候選抑癌基因的關(guān)鍵位點(diǎn)。miR-26a的基因組定位引起了我們的強(qiáng)烈興趣和極大關(guān)注。目前研究發(fā)現(xiàn),miR-26a的表達(dá)失調(diào)參與了抵御病原微生物入侵的天然免疫應(yīng)答、器官組織的發(fā)育分化以及多種實(shí)體瘤和造血系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)病機(jī)制等各種生物學(xué)過(guò)程。而令人費(fèi)解的是,miR-26a在不同腫瘤的發(fā)病機(jī)制中扮演了截然相反的雙重角色。在淋巴瘤、乳腺癌以及肝癌中,miR-26a在癌組織中表達(dá)降低,并發(fā)揮抑癌基因的作用；而在膠質(zhì)瘤中,miR-26a卻表達(dá)增高,扮演癌基因的角色。然而,迄今為止,鼻咽癌中關(guān)于miR-26a功能的相關(guān)研究卻鮮有報(bào)道。那么,鼻咽癌患者3p發(fā)生LOH是否引起miR-26a的表達(dá)失調(diào), miR-26a的表達(dá)失調(diào)在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展中又扮演著何種角色及其分子機(jī)理等一系列問(wèn)題都值得我們深入探討。 基于miR-26a的研究現(xiàn)狀及其在鼻咽癌癌變?cè)缙诜肿訖C(jī)制中的潛在意義,本課題的研究目的為明確miR-26a在鼻咽癌細(xì)胞和組織中的表達(dá)特性,探討miR-26a對(duì)鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及其在鼻咽癌發(fā)病機(jī)制中所發(fā)揮的重要作用,闡明miR-26a在鼻咽癌中發(fā)揮生物學(xué)功能的分子機(jī)理,為深入理解鼻咽癌發(fā)病的分子機(jī)制和尋找新的分子靶向治療靶點(diǎn)奠定理論基礎(chǔ)。 材料和方法 1.細(xì)胞培養(yǎng) 人鼻咽癌細(xì)胞株5-8F、6-10B、CNE1、CNE2、C666-1、HONE1和HNE-1采用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基,NP69采用KMSF培養(yǎng)基,293T細(xì)胞采用DMEM培養(yǎng)基,在37℃、5%CO2、飽和濕度的條件下傳代培養(yǎng),細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。 2.臨床標(biāo)本收集 18例鼻咽癌組織和16例鼻咽慢性炎組織均來(lái)源于南方醫(yī)院耳鼻喉科標(biāo)本庫(kù),所有標(biāo)本均為鼻咽部活檢組織,經(jīng)病理學(xué)檢查確診,鼻咽癌組織學(xué)分型為非角化性未分化型鱗癌,所有患者均尚未接受放化療治療。本研究經(jīng)南方醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所有患者均簽署知情同意書(shū)。 3.載體構(gòu)建 [1]慢病毒載體pLVTHM/miR-26a:該載體經(jīng)慢病毒包裝、感染細(xì)胞后可穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-26a,由本人在南方醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所攻讀碩士學(xué)位期間構(gòu)建成功。 [2] pGL3-EZH2 wt 3'UTR和pGL3-EZH2 mut 3'UTR:以正常人外周血基因組DNA為模板,擴(kuò)增EZH2 3'UTR (264bp),將該片段克隆到pGL3-control vector,得到重組質(zhì)粒pGL3-EZH2 wt3'UTR,然后將該重組質(zhì)粒進(jìn)行定點(diǎn)突變,得到突變質(zhì)粒pGL3-EZH2 mut3'UTR。 [3] Lenti-EZH2和Lenti-shEZH2:該慢病毒表達(dá)載體可分別過(guò)表達(dá)和穩(wěn)定干擾EZH2,由香港中文大學(xué)醫(yī)學(xué)院陳楊超教授惠贈(zèng)。 4.慢病毒包裝、濃縮及滴度測(cè)定 采用磷酸鈣沉淀法,將慢病毒表達(dá)載體(穿梭載體)和慢病毒包裝載體(psPAX2和pMD2.G)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,培養(yǎng)48～72h后收集病毒上清,超速離心進(jìn)行濃縮純化,倍比稀釋進(jìn)行滴度測(cè)定。 5.細(xì)胞轉(zhuǎn)染 [1] miRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染：采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體法進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,操作按LipofectamineTM 2000試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。6孔板中miRNA的轉(zhuǎn)染量為100nM。 [2]慢病毒感染：將慢病毒懸液按照不同的病毒感染復(fù)數(shù)感染鼻咽癌細(xì)胞,48h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光(green fluorescent protein, GFP)發(fā)光情況。鑒于慢病毒感染效率較高,以GFP為標(biāo)記,利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞分選獲得GFP陽(yáng)性細(xì)胞,分別建立過(guò)表達(dá)miR-26a、過(guò)表達(dá)EZH2、穩(wěn)定干擾EZH2的鼻咽癌細(xì)胞株。 [3] miRNA與質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染：操作按LipofectamineTM 2000試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。24孔板中miRNA的轉(zhuǎn)染量為50nM,重組質(zhì)粒pGL3-EZH2 wt3'UTR和pGL3-EZH2 mut 3'UTR的轉(zhuǎn)染量為100ng,內(nèi)對(duì)照pRL-SV40質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染量為5ng。 6.熒光定量PCR 抽提細(xì)胞和組織的總RNA和小分子RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后,采用sybrgreen法進(jìn)行PCR擴(kuò)增,通過(guò)相對(duì)定量以2-ΔΔCt值代表基因的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度。 7. Western blot 抽提細(xì)胞總蛋白,采用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定,然后10% SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、免疫雜交、顯影及定影,蛋白相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度采用Quantity One軟件進(jìn)行定量。 8.雙熒光素酶活性檢測(cè)將熒光素酶報(bào)告基因載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染36h后,將細(xì)胞裂解,然后利用GloMaxTM 96 Microplate Luminometer發(fā)光檢測(cè)儀分別測(cè)定Firefly luciferase和Renilla luciferase活性。共轉(zhuǎn)pRL-SV40質(zhì)粒作為內(nèi)對(duì)照用來(lái)校正轉(zhuǎn)染效率,以Firefly luciferase與Renilla luciferase活性的比值作為熒光素酶的相對(duì)活性,進(jìn)行不同樣品間的比較。 9.細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn) [11 MTT實(shí)驗(yàn)：將1x103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中,每孔體積200μl,每組5孔,同時(shí)設(shè)空白對(duì)照,分別培養(yǎng)1、2、3和4天。每孔加入5mg/ml的MTT20μl,37℃培養(yǎng)4h后終止培養(yǎng),小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基,加入二甲基亞砜150μl,室溫孵育10min,使結(jié)晶物充分溶解,以空白對(duì)照孔調(diào)零,酶標(biāo)儀上490nm測(cè)定各孔吸光度值(OD值),以相對(duì)應(yīng)OD比值表示細(xì)胞增殖能力大小。 [21平板克隆形成實(shí)驗(yàn)：接種200個(gè)細(xì)胞到6孔板中,保證細(xì)胞分散均勻,培養(yǎng)2周。出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的細(xì)胞克隆時(shí),終止培養(yǎng),棄去培養(yǎng)基,甲醇固定后結(jié)晶紫染色,顯微鏡下計(jì)數(shù)形成的克隆數(shù)(≥50個(gè)細(xì)胞為一個(gè)克隆)。平板克隆形成率=形成克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)x100%。 [3]細(xì)胞周期檢測(cè)：采用碘化丙錠(propidium iodide, PI)單染法檢測(cè)細(xì)胞周期分布。將細(xì)胞固定、Rnase A消化、PI染色后,流式細(xì)胞儀檢測(cè)。 10.動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 分別將過(guò)表達(dá)miR-26a的C666-1/miR-26a和對(duì)照組細(xì)胞C666-1/con隨機(jī)接種于10只裸鼠后背部皮下,接種細(xì)胞數(shù)為5×105,每組包括5只。每?jī)商煊糜螛?biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)短徑一次,按如下公式計(jì)算腫瘤體積：v=(D×d2)/2,其中D代表腫瘤最長(zhǎng)徑,而d代表腫瘤最短徑。待腫瘤體積超過(guò)500mm3,將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死,腫瘤組織取出后經(jīng)福爾馬林固定,石蠟包埋,切片后HE染色,光學(xué)顯微鏡觀察。 11.免疫組化 將石蠟切片進(jìn)行脫蠟、抗原修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶、血清封閉、抗體孵育、DAB顯色、復(fù)染、透明、封片等步驟進(jìn)行,免疫組化的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行半定量判定。隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野,如果核陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞數(shù)超過(guò)50%,則認(rèn)為該樣本陽(yáng)性。然后,按照細(xì)胞染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分：棕褐色3分,棕黃色2分,淡黃色1分,無(wú)著色0分。 12.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。MTT實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)皮下成瘤體積的比較采用析因設(shè)計(jì)的方差分析；免疫組化染色強(qiáng)度的比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)；鼻咽癌組織中miR-26a和EZH2表達(dá)水平的相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)系數(shù)；其他實(shí)驗(yàn)中涉及到兩組數(shù)據(jù)之間的比較均采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn),而三組或三組以上數(shù)據(jù)的比較均采用單因素方差分析,其多重比較采用SNK法。P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 1.鼻咽癌中miR-26a表達(dá)特性的鑒定 熒光定量PCR結(jié)果顯示,在7種鼻咽癌細(xì)胞株,即5-8F、6-10B、CNE1、CNE2、C666-1、HONE1和]HNE-1,miR-26a的表達(dá)均低于永生化鼻咽上皮細(xì)胞NP69(F=8.875,P0.001);而在18例非角化未分化型鼻咽癌組織中,miR-26a的平均表達(dá)水平比16例鼻咽慢性炎組織降低60%(t=-6.976,P0.001)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,miR-26a在鼻咽癌細(xì)胞和組織中表達(dá)下調(diào),為進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能提供了初步依據(jù)。我們推測(cè),3p LOH可能是引起鼻咽癌中miR-26a表達(dá)下調(diào)的最重要機(jī)制,尚有待進(jìn)一步證實(shí)。 2. miR-26a過(guò)表達(dá)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響 選取未分化鼻咽癌細(xì)胞株C666-1和低分化細(xì)胞株HNE-1作為細(xì)胞模型,研究miR-26a表達(dá)改變對(duì)鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。首先,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-26a mimic和inhibitor?熒光定量PCR檢測(cè)miR-26a表達(dá)的改變,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在C666-1和HNE-1中轉(zhuǎn)染miR-26a mimic后,miR-26a的表達(dá)分別增高了4.99(t=-9.650,P=0.001)和5.47倍(t=-11.307,P0.001)；而轉(zhuǎn)染anti-miR26a后,miR-26a的表達(dá)分別降低了85%(t=8.175,P=0.001)和80% (t=8.143,P=0.001)。該結(jié)果顯示,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-26a mimic和antimiR-26a可有效上調(diào)或下調(diào)miR-26a的表達(dá)。 隨后,通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞周期檢測(cè)觀察miR-26a表達(dá)改變對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖能力的影響。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染miR-26a mimic 96h后,C666-1和HNE-1細(xì)胞的生長(zhǎng)速度分別降低了42%(t=21.682,P0.001)和45%(t=26.662,P0.001)；而轉(zhuǎn)染anti-miR26a 96h后,兩種細(xì)胞的生長(zhǎng)速度分別加快了55%(t=-40.993,P0.001)和47%(t=-28.592,P0.001)。細(xì)胞周期分布顯示,miR-26a過(guò)表達(dá)使C666-1細(xì)胞G1期細(xì)胞比例顯著增高22%(t=-15.128,P0.001),而S比例顯著降低(t=13.173, P0.001), G2+M期細(xì)胞比例無(wú)顯著改變；而干擾miR-26a抑制其表達(dá),細(xì)胞周期分布無(wú)顯著差異(P0.05)。該結(jié)果表明,miR-26a過(guò)表達(dá)通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞周期G1期阻滯,抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖。 在此結(jié)果的基礎(chǔ)上,通過(guò)構(gòu)建miR-26a漫病毒表達(dá)載體,病毒包裝濃縮,以不同的感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI),分別感染C666-1和HNE-1細(xì)胞,熒光定量PCR檢測(cè)miR-26a的表達(dá),從而確定慢病毒感染鼻咽癌細(xì)胞的最佳MOI。結(jié)果表明,當(dāng)MOI=100時(shí),miR-26a的表達(dá)在C666-1和HNE-1中分別增高了9.46倍(F=152.822,P0.001)和10.83倍(F=152.871,P0.001),差異具有顯著性,故后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用MOI=100作為最佳感染復(fù)數(shù)。依據(jù)慢病毒載體所攜帶的GFP標(biāo)記,采用流式細(xì)胞儀分選(fluorescence activated cell sorter, FACS)獲得GFP陽(yáng)性細(xì)胞群,建立穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-26a的鼻咽癌細(xì)胞株C666-1/miR-26a和HNE-1/miR-26a。 利用該細(xì)胞株,通過(guò)平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了miR-26a過(guò)表達(dá)對(duì)癌細(xì)胞克隆形成能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),miR-26a過(guò)表達(dá)使C666-1和HNE-1細(xì)胞的克隆形成率分別降低44%(t=25.154,P0.001)和42%(t=-22.321,P0.001)。MTT實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞周期檢測(cè)的結(jié)果與瞬時(shí)轉(zhuǎn)染結(jié)果相一致,即miR-26a過(guò)表達(dá)通過(guò)誘導(dǎo)G1期阻滯抑制癌細(xì)胞增殖。此外,我們還將C666-1/miR-26a細(xì)胞接種裸鼠皮下,建立鼻咽癌異位移植瘤模型,進(jìn)一步研究miR-26a過(guò)表達(dá)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力的影響。結(jié)果表明,接種后第9天成瘤能力出現(xiàn)顯著性差異,C666-1/miR-26a細(xì)胞所形成的腫瘤體積顯著小于對(duì)照細(xì)胞(t=-6.649,P0.001)。至第15天,接種C666-1/miR-26a細(xì)胞形成的腫瘤體積比對(duì)照組細(xì)胞的腫瘤體積降低45%(t=-15.605,P0.001),且免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn),miR-26a過(guò)表達(dá)后顯著降低了Ki-67和PCNA的表達(dá)(P0.05)。 以上結(jié)果顯示,miR-26a參與了鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制,其表達(dá)失調(diào)與鼻咽癌細(xì)胞的體外增殖和體內(nèi)成瘤能力密切相關(guān),在鼻咽癌中扮演候選抑癌基因角色。 3. miR-26a抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖相關(guān)分子機(jī)理的探討 利用miRBase、TargetScan和miRanda三大數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)miR-26a進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)均預(yù)測(cè)組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2 (Enhancer ofZeste Homolog 2)為miR-26a的靶基因,且得分較高,結(jié)果可靠。在生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的基礎(chǔ)上,推測(cè)EZH2可能是miR-26a的靶基因。于是,我們構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGL3-wt EZH2 3'UTR和突變質(zhì)粒pGL3-mut EZH2 3'UTR,以便進(jìn)行雙熒光酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。將上述重組質(zhì)粒和miR-26a mimic、anti-miR26a共轉(zhuǎn)染C666-1細(xì)胞,檢測(cè)熒光素酶活性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)pGL3-wt 3'UTR和miR-26a mimic共轉(zhuǎn)染可顯著降低熒光素酶的活性(t=-13.026,P0.001),而將該重組質(zhì)粒與antimiR-26a共轉(zhuǎn)染后可顯著增強(qiáng)熒光素酶的活性(t=-8.370,P=0.001),表明miR-26a與EZH23'UTR可特異性結(jié)合。 隨后,通過(guò)采用5個(gè)不同的MOI,觀察miR-26a不同程度過(guò)表達(dá)對(duì)EZH2表達(dá)的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在C666-1細(xì)胞中,miR-26a過(guò)表達(dá)可顯著抑制EZH2mRNA (F=88.649, P0.001)和蛋白水平的表達(dá),且呈劑量依賴(lài)性,即miR-26a過(guò)表達(dá)程度越高對(duì)EZH2的抑制作用越明顯,在HNE-1細(xì)胞中也獲得類(lèi)似的結(jié)果(F=442.510,P0.001)。相反,沉默miR-26a后可顯著上調(diào)EZH2 mRNA和蛋白的表達(dá)(P0.001)。此外,我們還檢測(cè)了鼻咽癌組織中EZH2的表達(dá),結(jié)果顯示EZH2在鼻咽癌組織中表達(dá)上調(diào),其平均表達(dá)是水平慢性鼻咽炎組織的2.12倍(t=-5.818,P0.001),且EZH2 mRNA的表達(dá)與miR-26a在同一組鼻咽癌組織中呈負(fù)相關(guān)(r=-0.874,P0.001)。以上結(jié)果證實(shí),在鼻咽癌中EZH2為miR-26a的靶基因。 在以上結(jié)果的基礎(chǔ)上,又分別過(guò)表達(dá)和干擾EZH2,觀察EZH2表達(dá)改變對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖能力的影響。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在實(shí)驗(yàn)第4天,EZH2沉默后使C666-1細(xì)胞的增殖能力降低41%(F=612.085,P0.001),與miR-26a過(guò)表達(dá)引起類(lèi)似的抑制作用。而細(xì)胞周期檢測(cè)的結(jié)果同樣顯示,干擾EZH2與過(guò)表達(dá)miR-26a均可誘導(dǎo)G1期阻滯(F=223.443,P0.001)。隨后,我們?cè)贑666-1/miR-26a細(xì)胞中進(jìn)一步過(guò)表達(dá)EZH2,結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染96h后EZH2過(guò)表達(dá)可顯著逆轉(zhuǎn)miR-26a的增殖抑制作用,使細(xì)胞的生長(zhǎng)速度趨于正常(F=1078.465,P0.001),使G1期細(xì)胞比例顯著降低(F=360.732,P0.001)。該結(jié)果表明,miR-26a抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖的生物學(xué)功能是通過(guò)調(diào)控EZH2的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。 眾所周知,miRNA功能的發(fā)揮是通過(guò)調(diào)控成百上千個(gè)靶基因所構(gòu)成的龐大網(wǎng)絡(luò)來(lái)實(shí)現(xiàn)的,因此,為了深入解析miR-26a發(fā)揮功能的分子機(jī)理,我們進(jìn)一步檢測(cè)了C666-1細(xì)胞中p53和pRb信號(hào)通路以及c-myc等一系列細(xì)胞周期調(diào)控因子的表達(dá)。結(jié)果表明,miR-26a過(guò)表達(dá)和EZH2沉默均可抑制CCND3、CCNE2、CDK4、CDK6和c-myc,同時(shí)上調(diào)p14ARF和p21CIP1,而對(duì)CCND1、CCNE1、CDK2、p16INK4A、p53和pRb的表達(dá)無(wú)影響。此外,EZH2過(guò)表達(dá)還可逆轉(zhuǎn)miR-26a對(duì)上述基因的抑制作用。我們還發(fā)現(xiàn)miR-26a過(guò)表達(dá)可抑制CCND2,而EZH2對(duì)該基因并無(wú)調(diào)控作用,提示該基因可能為miR-26a在鼻咽癌中的另一靶基因。綜合以上結(jié)果,闡明了miR-26a參與鼻咽癌發(fā)病的分子機(jī)理,即通過(guò)調(diào)控靶基因EZH2,進(jìn)一步影響G1/S關(guān)鍵點(diǎn)相關(guān)調(diào)控因子的表達(dá),從而引起G1期阻滯抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖。 結(jié)論 1. miR-26a在鼻咽癌細(xì)胞株和組織中表達(dá)下調(diào)。 2. miR-26a參與了鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制,其表達(dá)失調(diào)影響癌細(xì)胞的體外增殖和體內(nèi)成瘤能力,發(fā)揮候選抑癌基因的功能。 3.在鼻咽癌中,EZH2為miR-26a的靶基因。 4. miR-26a通過(guò)調(diào)控靶基因EZH2,進(jìn)一步影響細(xì)胞周期相關(guān)調(diào)控因子的表達(dá),從而誘導(dǎo)G1期阻滯抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類(lèi)號(hào)】：R739.63

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本文編號(hào)：2254845