【摘要】：第一章小鼠堿燒傷完全性角膜緣干細胞功能失代償模型的建立及評價 目的 建立模擬臨床的小鼠堿燒傷完全性角膜緣干細胞功能失代償模型,為研究堿燒傷引發(fā)的完全性角膜緣干細胞功能失代償提供簡單、穩(wěn)定的動物模型。 方法 選取6-8周齡C57小鼠30只,全身麻醉后將浸有0.5mol/L氫氧化鈉溶液的環(huán)形濾紙片(內徑3mm,外徑5mm)置于角膜緣30秒后取下,然后應用生理鹽水沖洗結膜囊30秒；術后1天、3天、5天、7天、10天、14天、21天及30天,應用裂隙燈顯微鏡觀察角膜上皮完整性、基質透明性及新生血管化情況；每個時間點隨機抽取3只小鼠取材,進行組織病理學檢查；術后21天進行角膜免疫印跡細胞學檢查。 結果 ①裂隙燈檢查：術后1天：角膜緣缺血,可見邊界清楚的灰白色環(huán)狀混濁區(qū),大小與濾紙片直徑一致,全角膜水腫、上皮缺損；術后3-5天：角膜灰白色混濁,水腫加重；術后7-10天：角膜水腫逐漸減輕,上皮恢復完整；術后14天：角膜緣可見毛刷狀新生血管生長；術后21天：角膜緣較多新生血管長入角膜基質；術后30天：角膜混濁、新生血管化,部分模型發(fā)生瞼球粘連； ②HE染色：術后1-5天：角膜上皮層、基質層內可見大量炎癥細胞浸潤,角膜基質水腫、明顯增厚、膠原纖維排列不規(guī)則、較疏松；術后7-10天：角膜表面單層上皮覆蓋,基質水腫逐漸減輕,炎癥細胞浸潤減少；術后14天：角膜表面覆蓋2-3層上皮細胞,基質無明顯水腫,膠原纖維排列相對整齊；術后21天：角膜基質內較多新生血管增生,管腔內有成熟紅細胞；術后30天：角膜上皮層內可見較多杯狀細胞； ③免疫印跡細胞學檢查：角膜表面可見較多核大、核質比例約1/2、嗜伊紅染色的杯狀細胞,PAS染色陽性,為結膜細胞表型。 結論 ①應用環(huán)形濾紙片堿燒傷的方法制作小鼠完全性角膜緣干細胞功能失代償模型,角膜表面可見較多杯狀細胞,裂隙燈檢查見小鼠角膜的體征符合臨床上“完全性角膜緣干細胞功能失代償”的診斷標準。 ②此方法操作簡單,易于重復,為下一步的在體研究提供了良好的動物模型。 第二章小鼠眼部堿燒傷急性期骨髓間充質干細胞歸巢到角膜組織的檢測 目的 觀察小鼠眼部堿燒傷急性期骨髓間充質干細胞歸巢到角膜組織的時間窗、定植位置、以及影響因素。 方法 選取6-8周齡C57小鼠80只,隨機分為骨髓功能正常組、骨髓功能動員組(皮下注射重組人粒細胞集落刺激因子)及球結膜下注射組(球結膜下注射GFP轉染的小鼠骨髓間充質干細胞),建立完全性角膜緣干細胞功能失代償模型,分別于堿燒傷后1天、3天、5天、7天、10天、14d天、21天及30天取材： ①冰凍切片行CD29、CD44及CD45免疫熒光染色；球結膜下注射組應用熒光顯微鏡觀察GFP陽性細胞在眼表的位置； ②實時定量PCR檢測CD29、CD44、CD45、CD90、CD105及基質衍生因子1(SDF-1)的表達； ③包埋切片行SDF-1免疫組織化學檢測。 結果 ①免疫熒光染色：兩組呈現類似的表達規(guī)律：堿燒傷術后1-10天,角膜中央、周邊及角膜緣均未見CD29、CD44及CD45表達；術后14d、21d、30d,角膜緣可見少量CD29、CD44陽性表達,陽性反應物主要位于胞膜,但CD45均為陰性。 ②熒光顯微鏡：術后1天、3天、5天及7天,球結膜下、角膜緣及角膜中央均未見GFP陽性細胞； ③實時定量PCR：兩組呈現類似的表達規(guī)律：CD29、CD44、CD90及CD105：堿燒傷術后1-7天均未見表達,術后10天、14天、21天、30天呈現低水平表達；CD45：各個時間點均為陰性。 ④免疫組織化學檢測：兩組呈現類似的表達規(guī)律：術后7天：SDF-1呈現強陽性表達,陽性反應物主要位于角膜上皮細胞胞漿內；術后10-14天：陽性反應物逐漸減少；術后21天：SDF-1表達呈現陰性。 結論 ①小鼠眼部堿燒傷后14-30天,僅有少量骨髓間充質干細胞歸巢到角膜組織并聚集在角膜緣部位。 ②小鼠眼部堿燒傷后SDF-1表達增加,時間-劑量關系與心肌等組織相似,不是抑制骨髓間充質干細胞歸巢的關鍵因素。 第三章眼表炎癥因子及高滲透壓環(huán)境對小鼠骨髓間充質干細胞生物學性狀的影響 目的 檢測眼表主要炎癥因子(白介素-lβ)及高滲透壓環(huán)境(406Osm)對小鼠骨髓間充質干細胞形態(tài)、活細胞率、增殖及遷移能力等生物學性狀的影響。 方法 體外分離小鼠骨髓間充質干細胞進行培養(yǎng),設置正常對照組、5ng/ml IL-1β組、10ng/ml IL-1β組、20ng/ml IL-1β組及高滲組,分別應用MTT法、細胞克隆形成試驗、劃痕法進行檢測。 結果 ①細胞形態(tài)：原代培養(yǎng)的細胞呈梭形,排列具有方向性,胞漿豐富,細胞核較大,呈圓形,位于細胞中央；5ng/ml IL-1β組細胞形態(tài)無明顯差異；隨著培養(yǎng)基中IL-1β濃度升高,出現較多漂浮細胞,細胞變小,多呈圓形；高滲組培養(yǎng)基中出現大量漂浮細胞,貼壁細胞排列松散,形態(tài)不規(guī)則,失去梭形外觀,細胞膜皺縮,反光增強。 ②MTT法：正常對照組吸光度(0D值)為0.498±0.043(n=5)；5ng/m1IL-1β組0D值為0.499±0.038(n=5),與正常對照組相比,t=-0.035,P=-0.974,差異無統計學意義；10ng/ml IL-1β組、20ng/ml IL-1β組及高滲組0D值明顯減少,以高滲組為著,與正常對照組相比,tr,=6.209,Pt=0.003,t2=8.881,P2=0.001,tr=10.146,P.0.001,差異均具有統計學意義； ③細胞克隆形成試驗：正常對照組細胞能形成較多克隆,克隆形成率為18.200±1.923％(n=3)；5ng/ml IL-1β組克隆形成率下降至17.400±2.074%(n=3),與正常對照組相比,t=0.667,P=0.541,差異無統計學意義；10ng/ml IL-1β組、20ng/m1IL-1β組及高滲組克隆形成率進一步減少,以高滲組為著,與正常對照組相比,t1,=12.348,P1=0.000,t2=17.250,P2=0.000,t3=11.943,P3=0.000,差異均具有統計學意義； ④劃痕法：正常對照組細胞遷移能力旺盛,72小時全部越過劃痕；5ng/ml IL-1β組細胞遷移能力未受明顯影響,72小時全部越過劃痕；10ng/ml IL-1β組、20nng/mlIL-1β組及高滲組24小時、48小時及72小時細胞遷移能力均明顯下降,以高滲組為著,與正常對照組相比,差異均具有統計學意義。 結論 ①眼表高滲透壓環(huán)境能夠顯著地抑制骨髓間充質干細胞的遷移、增殖能力,較多細胞出現死亡現象。 ②低濃度IL-1β(5ng/ml)不具有細胞毒性,并且對骨髓間充質干細胞的遷移、增殖能力無明顯影響。 ③隨著培養(yǎng)基中IL-18濃度的升高(lOng/ml,20ng/ml),細胞毒性逐漸顯現,不同程度地抑制了骨髓間充質干細胞的遷移、增殖能力。 第四章小鼠眼部堿燒傷穩(wěn)定期骨髓間充質干細胞歸巢到角膜組織的檢測 目的 觀察小鼠眼部堿燒傷穩(wěn)定期骨髓間充質干細胞歸巢到角膜組織的時間窗及定植位置。 方法 選取6-8周齡C57小鼠80只,建立完全性角膜緣干細胞功能失代償模型,眼局部應用抗炎藥物一個月后進行后續(xù)實驗。隨機分為骨髓功能正常組(30只)、骨髓功能動員組(30只)及球結膜下注射組(20只)。分別于堿燒傷后1天、3天、5天、7天、10天、14天、21天及30天取材,進行裂隙燈照相、免疫熒光染色以及實時定量PCR檢測。 結果 ①裂隙燈照相：骨髓功能動員組及球結膜下注射組：小鼠角膜新生血管化程度降低,兩組之間無明顯差異。 ②免疫熒光染色：骨髓功能正常組：各個時間點,角膜緣可見極少量CD29、CD44表達,CD45均為陰性。骨髓功能動員組：術后1-3天,角膜緣可見少量CD29、CD44表達；術后5-10天,CD29、CD44陽性表達增加,CD45表達均為陰性；術后14天,CD29、CD44陽性表達開始減少；術后21天,CD29、CD44及CD45表達均為陰性； ③實時定量PCR： CD29、CD44、CD90及CD105的表達規(guī)律：骨髓功能正常組：各個時間點表達量較低；骨髓功能動員組：術后1-3天,表達量較低；5天開始升高,7-10天維持較高水平,14天時開始下降,21天少量表達,30天呈現陰性；球結膜下注射組：術后ld呈現高表達,以后逐漸降低,10d表達呈現陰性。骨髓功能動員組及球結膜下注射組角膜緣CD29、CD44、CD90及CD105的表達量明顯高于中央角膜。 ABCG2、P63、CK3/12及CK19的表達規(guī)律：骨髓功能動員組：ABCG2、P63及CK3/12表達量較高,CK19表達量較低,與骨髓功能正常組相比,差異均具有統計學意義；球結膜下注射組：ABCG2、P63及CK3/12表達量低于骨髓功能動員組,CK19表達量高于骨髓功能動員組,但二者相比,差異均不具有統計學意義。 結論 ①眼表微環(huán)境改善后,歸巢到角膜組織的骨髓間充質干細胞明顯增多,并有利于眼表向角膜上皮表型分化；應用粒細胞集落刺激因子進行骨髓動員可以提高歸巢效率。 ②穩(wěn)定期球結膜下注射骨髓間充質干細胞的眼表重建效果略優(yōu)于骨髓動員,但持續(xù)時間較短。 ③經骨髓動員或結膜下注射歸巢到角膜的骨髓間充質干細胞均聚集在角膜緣處,不向角膜中央發(fā)生移動。
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【學位授予單位】：青島大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R772.2

【參考文獻】

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1 張建江;易著文;黨西強;何小解;吳小川;;干細胞因子聯合粒細胞集落刺激因子對單側輸尿管梗阻大鼠骨髓干細胞及內皮祖細胞的動員作用[J];中國當代兒科雜志;2007年02期

2 林競韌,郭坤元,李江琪,嚴定安;人骨髓基質干細胞克隆的培養(yǎng)及其向神經元樣細胞的定向誘導分化[J];第一軍醫(yī)大學學報;2003年03期

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本文編號：2252048