【摘要】：研究背景： 喉癌是上呼吸道最常見的惡性腫瘤,占頭頸部腫瘤的25%左右。傳統(tǒng)的喉癌治療手段為根治性手術或放射治療,輔以或不輔以化學治療,但是傳統(tǒng)治療手段導致的喉功能部分甚至全部喪失或嚴重的副反應極大地影響了患者的生存質(zhì)量,且仍有部分患者出現(xiàn)治療后復發(fā)。盡管手術術式、放療方法及化療方案在革新中不斷進步,近30年來患者的生存率并無明顯改善。而失去根治性治療機會的晚期患者多行姑息性化療,長期以來該期患者的5年生存率始終停留在30%左右。 近20年來,分子靶向治療作為一種新型的治療手段在腫瘤的治療中取得了重大突破。對于頭頸部鱗狀細胞癌(Head and Neck Squamous Cell Carcinoma, HNSCC),最具代表性的分子靶向藥物為特異性抑制表皮生長因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR)的單克隆抗體及小分子酪氨酸激酶抑制劑。然而以吉非替尼為代表的小分子抑制劑對HNSCC并無明確療效,而以西妥西單抗為代表的單克隆抗體雖然對傳統(tǒng)的放、化療起到一定的輔助作用,然而由于有限的反應率,較高的耐藥率及頻發(fā)的皮膚毒性、消化道癥狀等副作用使得該類藥物的應用空間仍然不大。 隨著分子克隆技術的進步,以病毒為表達載體,通過RNA干擾技術特異性下調(diào)EGFR表達的基因治療策略為腫瘤的治療開辟了新的方向。而隨著RNA干擾技術的不斷改進,目前已出現(xiàn)人工microRNA (artificial microRNA, amiR),即第二代shRNA,與siRNA及第一代shRNA相比,人工microRNA在保留第一代shRNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)的基礎上,加入了天然microRNA的框架,除了更高效之外,最大的優(yōu)勢在于可以被哺乳動物體內(nèi)大多數(shù)的啟動子所啟動。而人工microRNA的這一優(yōu)勢使得采用腫瘤組織特異性啟動子來調(diào)控靶向EGFR的RNA干擾成為可能。 基于以上研究背景,我們擬設計以EGFR為靶點的人工microRNA,并利用重組腺病毒為載體,通過喉癌特異性的SLPI啟動子調(diào)控該人工microRNA的表達,并以Hep-2為研究對象,探討該基因治療策略抑制腫瘤生長的作用。 研究目的： 構(gòu)建荷載有在SLPI啟動子調(diào)控下的靶向EGFR的人工microRNA的重組腺病毒載體,并研究其安全性及對喉癌細胞的體內(nèi)外抑制作用。 研究方法： 1、構(gòu)建腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC312-SLPI-EGFRamiR-pA, Ad-SLPI-GFP-pA,分別與骨架質(zhì)粒pBGHlox (delta) E1,3Cre共轉(zhuǎn)染HEK293細胞進行腺病毒包裝。以PCR, western blot等方法鑒定重組腺病毒Ad-SLPI-EGFRamiR, Ad-SLPI-GFP。擴增病毒,并以CsCl密度梯度離心法純化擴增的腺病毒,TCID50法測定病毒滴度。 2、將重組腺病毒Ad-SLPI-EGFRamiR及對照病毒Ad-SLPI-GFP分別感染人喉鱗狀上皮癌細胞株Hep-2和人正常臍靜脈內(nèi)皮細胞株HuVEC,通過顯微鏡觀察,MTT,流式細胞儀細胞凋亡分析檢測病毒對喉癌細胞Hep-2及正常細胞HuVEC增殖的影響。 3、建立裸鼠喉癌荷瘤模型,予瘤內(nèi)注射重組腺病毒Ad-SLPI-EGFRamiR、 Ad-SLPI-GFP,或每日口服吉非替尼。比較治療過程中各組瘤體體積變化及觀察期結(jié)束后的瘤體重量。觀察治療過程中裸鼠的飲食、活動及精神狀態(tài),并比較裸鼠體重的變化情況。 研究結(jié)果： 1重組腺病毒Ad-SLPI-EGFRamiR, Ad-SLPI-GFP的包裝,鑒定、擴增、純化及滴度測定 腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC312-SLPI-EGFRamiR-pA、pDC312-SLPI-GFP-pA分別與骨架質(zhì)粒pBGHlox (delta) E1,3Cre共轉(zhuǎn)染HEK293細胞,轉(zhuǎn)染第13天左右,倒置顯微鏡下觀察,發(fā)現(xiàn)80%以上的細胞都發(fā)生細胞病變效應,呈葡萄狀,貼壁不牢易脫落。收集感染細胞,反復凍融,病毒上清經(jīng)蛋白酶K處理后,PCR檢測示Ad-SLPI-EGFRamiR擴增出不同重復序列數(shù)的EGFRamiR片段,142bp、284bp、426bp片段,Ad-SLPI-GFP擴增出1482bp片段,示重組腺病毒Ad-SLPI-EGFRamiR及對照病毒Ad-SLPI-GFP構(gòu)建成功。予擴增純化后進行滴度測定。Ad-SLPI-EGFRamiR滴度為1×1010pfu/ml, Ad-SLPI-GFP滴度為6.3×109pfu/ml。 Western blot結(jié)果顯示,Ad-SLPI-EGFRamiR病毒作用72小時的Hep-2細胞,170kdEGFR表達顯著降低。而Ad-SLPI-GFP感染72小時后,熒光顯微鏡下可見大量Hep-2細胞呈現(xiàn)較強的綠色熒光信號,而HuVEC細胞仍無綠色熒光。以上結(jié)果表明,SLPI啟動子能夠在喉癌細胞內(nèi)有效下調(diào)EGFR,并特異性調(diào)控綠熒光蛋白在人喉鱗狀細胞癌細胞株Hep-2細胞中表達,而在正常人臍靜脈內(nèi)皮細胞HuVEC中無表達,72小時為合適的感染時間。 2重組腺病毒Ad-SLPI-EGFRamiR對喉癌細胞Hep-2的體外抑制作用 2.1重組腺病毒對細胞增殖抑制作用的試驗 MTT結(jié)果顯示,感染72小時后重組腺病毒Ad-SLPI-EGFRamiR對喉癌細胞Hep-2的增殖有較強的抑制作用,在MOI為50pfu/cell時就能有效地抑制喉癌細胞的增殖(抑制率為22.5%),但對正常細胞HuVEC的增殖卻無明顯抑制作用(抑制率為-4.2%)。 2.2重組腺病毒作用72小時后細胞形態(tài)學變化 重組腺病毒Ad-SLPI-EGFRamiR (MOI=50)作用72小時后的喉癌細胞Hep-2在形態(tài)學上發(fā)生了顯著的變化：細胞變圓,皺縮,部分呈串珠狀、浮起。而正常細胞HuVEC在病毒作用前后細胞形態(tài)差異不明顯。而對照病毒Ad-SLPI-GFP (MOI=50)作用前后,Hep-2及HuVEC細胞形態(tài)均無明顯差異。 2.3流式細胞儀定量分析細胞凋亡 流式細胞儀檢測顯示重組腺病毒Ad-SLPI-EGFRamiR在MOI=35及MOI=50下作用72小時后,Hep-2細胞的凋亡率(層Annexin V-R-PE和7-AAD均染色的細胞)分別為32.8%和31.8%,而Ad-SLPI-GFP作用72小時后相應的凋亡率分別為9.2%和10.0%,兩種病毒差異顯著,從定量角度說明重組腺病毒Ad-SLPI-EGFRamiR能通過有效誘導凋亡而對喉癌細胞的生長增殖起抑制作用。而對于正常臍靜脈內(nèi)皮細胞HuVEC,在MOI=35的Ad-SLPI-EGFRamiR, Ad-SLPI-GFP作用72小時后的凋亡率分別為11.1%,8.2%,在MOI=50的相應病毒作用下凋亡率分別為15.5%,4.8%,差異均不顯著。 3重組腺病毒Ad-SLPI-EGFRamiR對喉癌荷瘤模型腫瘤組織生長的抑制作用 3.1重組腺病毒Ad-SLPI-EGFRamiR的體內(nèi)抑制腫瘤生長作用 在首次治療后第13天,Ad-SLPI-EGFRamiR治療組的瘤體體積小于Ad-SLPI-GFP組及吉非替尼組,但是這一差別無統(tǒng)計學上的顯著意義(P0.05)。與首次治療日的瘤體體積相比,Ad-SLPI-EGFRamiR組的瘤體體積增長速度小于Ad-SLPI-GFP組及吉非替尼組,但是仍無統(tǒng)計學上的顯著意義(P0.05)。在觀察結(jié)束時(首次給藥后第20天)Ad-SLPI-EGFRamiR組瘤重小于Ad-SLPI-GFP組及吉非替尼組,但這一差別無統(tǒng)計學上的顯著意義(P0.05)。 3.2重組腺病毒Ad-SLPI-EGFRamiR的體內(nèi)不良反應觀察 在治療過程中,Ad-SLPI-EGFRamiR組及Ad-SLPI-GFP組裸鼠的身體狀況良好,精神狀態(tài)、活動及飲食情況均無明顯異常。但是吉非替尼組的部分小鼠出現(xiàn)精神萎靡、腹瀉、食欲不振情況。Ad-SLPI-EGFRamiR組裸鼠的體重增長率與Ad-SLPI-GFP組裸鼠相比無明顯差異(P0.05),但是卻明顯高于吉非替尼組(P0.05)。 研究結(jié)論： 1、重組腺病毒Ad-SLPI-EGFRamiR和Ad-SLPI-GFP均能有效感染Hep-2細胞,并表達相應的基因,具有良好的喉癌組織特異性。 2、重組腺病毒Ad-SLPI-EGFRamiR在體外能顯著地特異性抑制喉癌細胞的生長,而對正常細胞抑制作用較低。 3、在荷瘤裸鼠模型中,重組腺病毒Ad-SLPI-EGFRamiR有抑制腫瘤組織生長的趨勢。 4、在荷瘤裸鼠模型中,重組腺病毒與吉非替尼相比具有較高的安全性。
[Abstract]:Research background:
Laryngeal cancer is the most common malignant tumor of the upper respiratory tract, accounting for about 25% of the head and neck tumors. The traditional treatment of laryngeal cancer is radical surgery or radiotherapy, supplemented by or not supplemented by chemotherapy. However, the loss of laryngeal function or serious side effects caused by traditional treatment greatly affect the quality of life of patients. Although surgical procedures, radiotherapy and chemotherapy regimens have progressed steadily, the survival rate of patients has not improved significantly in the past 30 years.
In the past 20 years, molecular targeted therapy has made great breakthroughs in the treatment of tumors. For head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC), the most representative molecular targeted drug is the specific inhibitor of epidermal growth factor receptor (EGF). R) Monoclonal antibodies and small molecule tyrosine kinase inhibitors. However, the small molecule inhibitors represented by gefitinib have no definite effect on HNSCC. While the monoclonal antibodies represented by cetuximab play an auxiliary role in traditional radiotherapy and chemotherapy, however, due to the limited response rate, high drug resistance rate and frequent occurrence. Skin toxicity, gastrointestinal symptoms and other side effects make the application space of these drugs still small.
With the advancement of molecular cloning technology, gene therapy strategy with virus as expression vector and down-regulation of EGFR expression by RNA interference technology has opened up a new direction for tumor treatment. Compared with shRNA, artificial microRNAs incorporate a natural microRNA framework based on retaining the hairpin structure of the first generation of shRNA. In addition to being more efficient, the greatest advantage is that they can be activated by most of the promoters in mammals. This advantage of artificial microRNAs enables the use of tumor tissue-specific promoters to regulate targets. RNA interference with EGFR becomes possible.
Based on the above research background, we intend to design an artificial microRNA targeting EGFR, and use recombinant adenovirus as vector to regulate the expression of the artificial microRNA through the specific SLPI promoter of laryngeal cancer. We also take Hep-2 as the research object to explore the effect of this gene therapy strategy on tumor growth.
Research purposes:
To construct recombinant adenovirus vector loaded with artificial microRNA targeting EGFR under the control of SLPI promoter, and to study its safety and inhibitory effect on laryngeal cancer cells in vitro and in vivo.
Research methods:
1. Adenovirus shuttle plasmids pDC312-SLPI-EGFRamiR-pA and Ad-SLPI-GFP-pA were constructed and co-transfected into HEK293 cells with cytoskeleton plasmids pBGHlox (delta) E1 and 3Cre respectively for adenovirus packaging. Virus titer was determined by TCID50.
2. Human laryngeal squamous cell carcinoma cell line Hep-2 and human normal umbilical vein endothelial cell line HuVEC were infected with recombinant adenovirus Ad-SLPI-EGFRamiR and control virus Ad-SLPI-GFP respectively. The effects of the recombinant adenovirus on the proliferation of laryngeal carcinoma cell line Hep-2 and normal cell HuVEC were examined by microscopy, MTT and flow cytometry.
3. To establish a tumor-bearing model of laryngeal carcinoma in nude mice, we injected recombinant adenovirus Ad-SLPI-EGFRamiR, Ad-SLPI-GFP into the tumor, or orally administered gefitinib daily.
Research findings:
1 packaging, identification, amplification, purification and titer determination of recombinant adenovirus Ad-SLPI-EGFRamiR, Ad-SLPI-GFP
Adenovirus shuttle plasmids pDC312-SLPI-EGFRamiR-pA and pDC312-SLPI-GFP-pA were co-transfected into HEK293 cells with cytoskeleton plasmids pBGHlox (delta) E1 and 3Cre, respectively. About 13 days after transfection, the cells were observed under inverted microscope. More than 80% of the cells showed grape-like cytopathic effect and were not easy to fall off. After the supernatant was treated with protease K, PCR showed that the EGFRamiR fragments with different repeat numbers, 142 bp, 284 bp, 426 bp, were amplified by Ad-SLPI-EGFRamiR, and 1482 BP fragments were amplified by Ad-SLPI-EGFRamiR. The recombinant adenovirus Ad-SLPI-EGFRamiR and the control virus Ad-SLPI-GFP were successfully constructed. For 1 x 1010pfu/ml, the titer of Ad-SLPI-GFP is 6.3 * 109pfu/ml..
Western blot showed that the expression of 170kdEGFR was significantly decreased in Hep-2 cells treated with Ad-SLPI-EGFRamiR virus for 72 hours. However, after 72 hours of infection with Ad-SLPI-GFP, a large number of Hep-2 cells showed strong green fluorescence signal under fluorescence microscope, while HuVEC cells still showed no green fluorescence. EGFR was effectively down-regulated internally and the expression of green fluorescent protein was specifically regulated in human laryngeal squamous cell carcinoma cell line Hep-2, but not in normal human umbilical vein endothelial cell HuVEC. 72 hours was the appropriate infection time.
Inhibitory effect of recombinant adenovirus Ad-SLPI-EGFRamiR 2 on laryngeal carcinoma cell Hep-2 in vitro
2.1 inhibitory effect of recombinant adenovirus on cell proliferation
MTT results showed that the recombinant adenovirus Ad-SLPI-EGFRamiR had a strong inhibitory effect on the proliferation of laryngeal carcinoma Hep-2 cells 72 hours after infection, and could effectively inhibit the proliferation of laryngeal carcinoma cells at MOI 50 pfu/cell (inhibition rate was 22.5%), but had no significant inhibitory effect on the proliferation of normal HuVEC cells (inhibition rate was - 4.2%).
2.2 the morphological changes of the recombinant adenovirus after 72 hours.
After 72 hours of treatment with recombinant adenovirus Ad-SLPI-EGFRamiR (MOI=50), the morphological changes of Hep-2 cells were marked: the cells became round, shrunk, part beaded and floated. The morphological differences of HuVEC cells in normal cells were not obvious before and after treatment with adenovirus Ad-SLPI-EGFRamiR (MOI=50). There was no significant difference in cell morphology.
2.3 quantitative analysis of apoptosis by flow cytometry
Flow cytometry showed that the apoptosis rates of Hep-2 cells (cells stained by Annexin V-R-PE and 7-AAD) were 32.8% and 31.8% respectively 72 hours after the recombinant adenovirus Ad-SLPI-EGFRamiR was treated with MOI=35 and MOI=50, while the corresponding apoptosis rates of Hep-2 cells treated with Ad-SLPI-GFP for 72 hours were 9.2% and 10.0% respectively. The difference between the two viruses was significant quantitatively. These results suggest that recombinant adenovirus Ad-SLPI-EGFRamiR can effectively induce apoptosis and inhibit the growth and proliferation of laryngeal cancer cells, while for normal umbilical vein endothelial cells HuVEC, the apoptosis rates of AD-SLPI-EGFRamiR and Ad-SLPI-GFP after 72 hours treatment are 11.1% and 8.2% respectively, and the apoptosis rates of HuVEC treated with the corresponding virus MOI=50 are 15. 5%, 4.8%, the difference is not significant.
Inhibitory effect of recombinant adenovirus Ad-SLPI-EGFRamiR 3 on growth of tumor tissue in laryngeal carcinoma model
3.1 inhibitory effect of recombinant adenovirus Ad-SLPI-EGFRamiR on tumor growth in vivo
On the 13th day after the first treatment, the tumor volume of the Ad-SLPI-EGFRamiR group was smaller than that of the Ad-SLPI-GFP group and the gefitinib group, but the difference was not statistically significant (P 0.05). Compared with the tumor volume of the first treatment day, the growth rate of the tumor volume of the Ad-SLPI-EGFRamiR group was smaller than that of the Ad-SLPI-GFP group and the gefitinib group, but there was no significant difference. Significant statistical significance (P 0.05). At the end of the observation (20 days after the first administration), the tumor weight of the Ad-SLPI-EGFRamiR group was less than that of the Ad-SLPI-GFP group and the gefitinib group, but there was no significant difference (P 0.05).
3.2 adverse effects of recombinant adenovirus Ad-SLPI-EGFRamiR in vivo
During the course of treatment, the nude mice in the Ad-SLPI-EGFRamiR group and the Ad-SLPI-GFP group were in good physical condition, mental state, activity and dietary condition without obvious abnormalities. The difference (P0.05) was significantly higher than that in gefitinib group (P0.05).
Research conclusions:
1. The recombinant adenovirus Ad-SLPI-EGFRamiR and AD-SLPI-GFP can effectively infect Hep-2 cells and express the corresponding genes, which has good tissue specificity for laryngeal carcinoma.
2. The recombinant adenovirus Ad-SLPI-EGFRamiR can inhibit the growth of laryngeal carcinoma cells in vitro, but has a low inhibitory effect on normal cells.
3, in nude mice bearing tumor, recombinant adenovirus Ad-SLPI-EGFRamiR has a tendency to inhibit the growth of tumor tissue.
4, in nude mice bearing tumor, the recombinant adenovirus has high safety compared with gefitinib.
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R739.65;R450

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本文編號：2250550