【摘要】： 鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是一種具有地域特異性的惡性腫瘤,在中國南部居惡性腫瘤發(fā)病率的第三位,與EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)感染密切相關(guān)。LMP1是EBV編碼的瘤蛋白,其生物學(xué)功能涉及細(xì)胞轉(zhuǎn)化、凋亡、分化、細(xì)胞周期行進(jìn)以及參與惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。以鼻咽癌為切入點(diǎn),我們多年的研究工作一直致力于LMP1介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究,系統(tǒng)地研究了LMP1介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常以及由此產(chǎn)生的一系列生物學(xué)效應(yīng)。 轉(zhuǎn)錄因子是參與調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄的的反式作用因子,能直接或間接識(shí)別或結(jié)合在各順式作用元件核心序列上,參與調(diào)控轉(zhuǎn)錄效率。轉(zhuǎn)錄因子是上游信號(hào)傳導(dǎo)事件與下游功能基因表達(dá)改變的聯(lián)系紐帶,也是信號(hào)傳導(dǎo)研究的重要核心。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)是一個(gè)170kDa的跨膜糖蛋白,屬于受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases, RTKs)家族成員。傳統(tǒng)的受體學(xué)說認(rèn)為,細(xì)胞膜受體作為第一信使,在細(xì)胞膜上與其配體結(jié)合發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng),但細(xì)胞膜受體不能進(jìn)入核內(nèi)而不能直接影響基因轉(zhuǎn)錄。但近年來,在許多腫瘤如皮膚癌、乳腺癌、宮頸癌、膀胱癌、卵巢癌等的細(xì)胞核內(nèi)發(fā)現(xiàn)高水平的EGFR表達(dá),其作為一種新型轉(zhuǎn)錄因子在核內(nèi)獨(dú)立或作為轉(zhuǎn)錄共活化子與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用于與細(xì)胞周期行進(jìn)或細(xì)胞增殖密切相關(guān)的靶基因,促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。轉(zhuǎn)錄因子STAT3 (signal transducer and activation of transcription3, STAT3)是多種細(xì)胞因子和生長因子發(fā)揮作用的關(guān)鍵信號(hào)分子,其通過酪氨酸磷酸化的STAT之間形成同源二聚體或異源二聚體而活化,活化后移位至細(xì)胞核,激活多種相關(guān)下游靶基因的表達(dá)。STAT3蛋白能識(shí)別靶基因啟動(dòng)子區(qū)的保守序列成分并通過該序列激活靶基因轉(zhuǎn)錄。 本室的前期研究首先發(fā)現(xiàn)在鼻咽癌細(xì)胞中LMP1通過其CTAR1 (carboxyterminal activating region 1,CTAR1)募集腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(Tumor Necrosis Factor Receptor Associated Factors, TRAFs)精細(xì)調(diào)控EGFR表達(dá)和上調(diào)EGFR磷酸化水平,進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖,繼首次發(fā)現(xiàn)LMP1可以調(diào)控EGFR核移位,并呈EGF配體非依賴性。據(jù)報(bào)道用EGF刺激細(xì)胞后應(yīng)用激光共聚焦檢查觀察,10分鐘即可細(xì)胞核內(nèi)發(fā)現(xiàn)核EGFR的存在。同時(shí),不少作者認(rèn)為EGFR需與其他能直接結(jié)合于靶基因DNA的轉(zhuǎn)錄因子相互作用方能發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增殖的生物學(xué)作用。本室前期研究還發(fā)現(xiàn)在鼻咽癌細(xì)胞中存在LMP1激活的JAK/STAT信號(hào)通路,并且LMP1激活STAT途徑的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)在于其CTAR2和CTAR3的協(xié)同作用。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)LMP1通過JAK3促進(jìn)STAT3酪氨酸705位磷酸化,磷酸化活化后的STAT3即核移位并核內(nèi)積聚,并且LMP1調(diào)控磷酸化STAT3核移位呈705位酪氨酸磷酸化依賴性。我們推測(cè)LMP1有可能通過誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子EGFR和STAT3核移位調(diào)節(jié)其相互作用。為觀察在LMP1調(diào)控下轉(zhuǎn)錄因子EGFR和STAT3在鼻咽癌細(xì)胞核內(nèi)是否存在共定位,選擇激光共聚焦掃描顯微鏡進(jìn)行檢測(cè),以LMP1陰性表達(dá)的鼻咽癌細(xì)胞CNE1細(xì)胞為陰性對(duì)照,發(fā)現(xiàn)在LMP1陽性表達(dá)的鼻咽癌細(xì)胞CNE1-LMP1細(xì)胞內(nèi)存在EGFR和STAT3蛋白的共定位；應(yīng)用免疫共沉淀[Co-immunoprecipitation (CO-IP)-western blot(WB)]方法檢測(cè),顯示LMP1可調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子EGFR和STAT3呈復(fù)合物結(jié)合；再分別用胞漿和核蛋白做免疫共沉淀及western-blot檢測(cè)表明EGFR和STAT3復(fù)合物結(jié)合的主要亞細(xì)胞定位是細(xì)胞核。以上結(jié)果為LMP1調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子EGFR和STAT3在鼻咽癌細(xì)胞核內(nèi)的作用機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 腫瘤作為一類細(xì)胞周期病,G1/S檢測(cè)點(diǎn)常在癌變多階段,甚至在癌前階段就已失調(diào)。細(xì)胞周期調(diào)節(jié)系統(tǒng)是腫瘤發(fā)生過程中常發(fā)生改變的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò),尤其是cyclin D,作為一種調(diào)節(jié)G1/S期行進(jìn)的重要正性調(diào)節(jié)蛋白,是連接外界生長因子、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制的紐帶,常成為腫瘤發(fā)生過程中的分子靶。Cyclin D1是腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期中G1期向S期行進(jìn)必不可少的蛋白質(zhì)之一,cyclin D1基因已被證實(shí)是重要瘤基因,cyclinD1的主要功能是促進(jìn)細(xì)胞的增殖,而其基因轉(zhuǎn)錄受多種因素的調(diào)節(jié)。本室的前期研究發(fā)現(xiàn)LMP1可以活化cyclinD1的表達(dá),EGFR可直接結(jié)合于細(xì)胞周期G1/S期調(diào)節(jié)分子cyclinD1和cyclin E啟動(dòng)子區(qū),并反式激活cyclinD1和cyclin E啟動(dòng)子活性,文獻(xiàn)證實(shí)STAT3可以通過與cyclin D1啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合并調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄功能。 為探討LMP1調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子EGFR/STAT3作用的靶基因是否是cyclin D1基因,以LMP1表達(dá)陰性的鼻咽癌細(xì)胞CNE1和LMP1陽性表達(dá)的CNE1-LMP1細(xì)胞為模型,采用脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法將cyclin D1報(bào)道基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至CNE1、CNE1-LMP1細(xì)胞系后,進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因分析。同時(shí)利用特異性靶向LMP1的脫氧核酶DZ1阻斷LMP1的表達(dá)后,進(jìn)行報(bào)告基因分析,發(fā)現(xiàn)CNE1-LMP1細(xì)胞的cyclin D啟動(dòng)子活性明顯高于CNE1,轉(zhuǎn)染了特異性靶向LMP1的脫氧核酶DZ1的CNE1-LMP1細(xì)胞系的報(bào)告基因活性顯著低于未經(jīng)DZ1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。結(jié)果提示了LMP1能夠有效地分別調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子EGFR和STAT3反式激活cyclinD1的活性。進(jìn)一步通過小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)沉寂靶基因RNA策略,將EGFRsiRNA,STAT3siRNA分別和共同與cyclinD1報(bào)道質(zhì)粒及轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染CNE1-LMP1細(xì)胞后,進(jìn)行報(bào)告基因檢測(cè),并與加入非特異性siRNA的對(duì)照組比較,發(fā)現(xiàn)前組各自的cyclinD1報(bào)道基因活性都明顯降低,T'檢驗(yàn),P值0.05,差異有顯著性意義；共轉(zhuǎn)染EGFRsiRNA和STAT3siRNA組的cyclinD1報(bào)道基因活性比各單獨(dú)轉(zhuǎn)染組更降低。提示不論獨(dú)立或同時(shí)沉寂cyclinD1啟動(dòng)子區(qū)EGFR和STAT3mRNA均可降低LMP1調(diào)控的cyclinD1啟動(dòng)子活性,從另一方面證明LMP1通過轉(zhuǎn)錄因子EGFR和STAT3調(diào)節(jié)cyclin D1啟動(dòng)子活性。為探討LMP1是否可經(jīng)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子EGFR/STAT3而調(diào)節(jié)cyclin D1 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平,通過GeneBank和Primer3引物設(shè)計(jì)軟件搜索和設(shè)計(jì)合成人Cyclin D1的cDNA引物序列進(jìn)行了real-time PCR檢測(cè),經(jīng)分別轉(zhuǎn)染EGFRsiRNA和STAT3siRNA與非特異性對(duì)照siRNA于CNE1-LMP1細(xì)胞,提取其mRNA進(jìn)行real-time PCR實(shí)驗(yàn),顯示LMP1可通過轉(zhuǎn)錄因子EGFR. STAT3對(duì)CyclinD1 mRNA表達(dá)水平進(jìn)行不同程度的調(diào)節(jié)；但是同時(shí)沉寂EGFR、STAT3轉(zhuǎn)錄因子并未顯示其抑制作用強(qiáng)于兩轉(zhuǎn)錄因子的分別沉寂的抑制作用,表現(xiàn)了CyclinD1 mRNA表達(dá)調(diào)控的復(fù)雜性。 文獻(xiàn)報(bào)道大量的細(xì)胞膜受體可以核移位,如EGFR, HER-2, FGFR(Fibroblast growth factor receptor, FGFR), HER-3。膜受體核移位后如何作用于靶基因的分子機(jī)制至今尚未完全明了。據(jù)報(bào)道EGFR核移位后能識(shí)別并結(jié)合至cyclinDl啟動(dòng)子區(qū)富含AT的保守序列(AT-rich consensus sequence, ATRS)并反式激活cyclinDl基因的表達(dá),但并未研究清楚EGFR是否能直接結(jié)合于cyclinD1啟動(dòng)子ATRS;另有作者認(rèn)為EGFR缺乏DNA結(jié)合域,需與其他能直接結(jié)合于DNA的轉(zhuǎn)錄因子相互作用方能發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增殖的生物學(xué)作用。激活后的STAT3即可核移位,通過識(shí)別靶基因上STAT3特異性的DNA結(jié)合成分而與其結(jié)合,并激活靶基因的轉(zhuǎn)錄。有作者發(fā)現(xiàn)STAT3蛋白的轉(zhuǎn)錄活性需要募集共活化子共同作用,如需與EGFR共同靶向iNOS啟動(dòng)子才能最大程度地促進(jìn)iNOS基因表達(dá)。鼻咽癌細(xì)胞cyclin D1啟動(dòng)子區(qū)是否存在EGFR與STAT3共結(jié)合DNA序列,LMP1通過轉(zhuǎn)錄因子EGFR和STAT3調(diào)控cyclin D1轉(zhuǎn)錄的作用機(jī)制是通過對(duì)cyclinD1啟動(dòng)子區(qū)EGFR、STAT3各自獨(dú)立結(jié)合位點(diǎn)或EGFR/STAT3共結(jié)合位點(diǎn)而發(fā)揮生物調(diào)控作用?首先分析LMP1通過誘導(dǎo)EGFR、STAT3分別與cyclinD1基因啟動(dòng)子區(qū)各自的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合并反式激活作用,通過電泳遷移率變動(dòng)分析(electrophoretic mobility shift assay, EMSA),并且基于已證實(shí)的某些小分子抑制劑可阻斷LMP1誘導(dǎo)EGFR/STAT3的主要磷酸化位點(diǎn)激活,而抑制其核移位的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),采用小分子阻斷策略觀察抑制EGFR/STAT3核移位后對(duì)其與CyclinD1啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合能力的影響。結(jié)果顯示LMP1陽性細(xì)胞核蛋白與生物素標(biāo)記野生型EGFR形成的結(jié)合帶明顯強(qiáng)于LMP1陰性表達(dá)細(xì)胞,提示LMP1能夠調(diào)控EGFR與CyclinD1啟動(dòng)子區(qū)EGFR結(jié)合位點(diǎn)DNA的結(jié)合。利用酪氨酸激酶小分子抑制劑AG1478阻斷EGFR磷酸化途徑后,其與CyclinD1啟動(dòng)子區(qū)DNA結(jié)合能力降低,表明酪氨酸激酶抑制劑AG1478能夠降低LMP1調(diào)控的EGFR與CyclinD1啟動(dòng)子區(qū)DNA結(jié)合的能力,這從另一方面證實(shí)LMP1可調(diào)控EGFR與CyclinD1啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合。同時(shí)發(fā)現(xiàn)LMP1能夠調(diào)控STAT3與CyclinD1啟動(dòng)子區(qū)STAT3結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合能力,利用小分子阻斷劑WHI-p131, PD98059,阻斷STAT3磷酸化后,可以降低STAT3與CyclinD1啟動(dòng)子DNA結(jié)合能力,證實(shí)LMP1可調(diào)控STAT3與CyclinD1啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合能力。進(jìn)一步通過報(bào)告基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)LMP1通過EGFR和STAT3誘導(dǎo)上調(diào)的cylinD1啟動(dòng)子活性能被EGFRTry1173位磷酸化,STAT3酪氨酸705位磷酸化和STAT3絲氨酸727位磷酸化的小分子阻斷劑分別不同程度地抑制。這些結(jié)果從正反兩方面證明了LMP1可通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子EGFR和STAT3結(jié)合于cyclinD1啟動(dòng)子區(qū)各自的結(jié)合位點(diǎn)而調(diào)節(jié)cyclin D1啟動(dòng)子活性的作用機(jī)制。 根據(jù)分子生物學(xué)信息技術(shù)及參考文獻(xiàn),我們推測(cè)在cyclin D1啟動(dòng)子區(qū)存在EGFR和STAT3共結(jié)合(consensus)潛在的位點(diǎn),分析其序列為TTCTATGAA.經(jīng)分析在CYCLIND1啟動(dòng)子區(qū)只有一個(gè)EGFR和STAT3潛在的共結(jié)合位點(diǎn)TTCTATGAA。根據(jù)該序列設(shè)計(jì)PCR引物,采用CHIP(Chromatin immunoprecipitation, CHIP、PCR及瓊脂糖凝膠電泳分析,顯示CNE1-LMP1活體細(xì)胞內(nèi)Cyclin D1啟動(dòng)子區(qū)存在EGFR、STAT3結(jié)合的共結(jié)合序列；不能忽略的是CNE1細(xì)胞內(nèi)CyclinD1啟動(dòng)子區(qū)也存在與EGFR、STAT3結(jié)合的共序列,這個(gè)共序列的存在也可能是鼻咽癌細(xì)胞的共同生物結(jié)構(gòu)特征；通過設(shè)計(jì)并合成包含EGFR/STAT3共結(jié)合序列的生物素標(biāo)記探針,采用EMSA分析發(fā)現(xiàn)CNE1-LMP1細(xì)胞核蛋白與生物素標(biāo)記野生型探針結(jié)合能力顯著高于CNE1細(xì)胞,提示LMP1可以調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子STAT3和EGFR與cyclinD1基因啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合位點(diǎn)共序列的結(jié)合能力。運(yùn)用點(diǎn)突變?cè)瓌t將cyclin D1啟動(dòng)子報(bào)道基因質(zhì)粒推測(cè)的EGFR和STAT3共序列的部分關(guān)鍵核苷酸進(jìn)行點(diǎn)突變,使轉(zhuǎn)錄因子EGFR和STAT3不能與cyclinD 1啟動(dòng)子區(qū)的共結(jié)合序列結(jié)合,從而不能反式激活cyclinD1,再轉(zhuǎn)染CNE1和CNE1-LMP1細(xì)胞進(jìn)行報(bào)告基因檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)點(diǎn)突變后LMP1細(xì)胞cylin D1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性明顯降低,約1倍,t'檢驗(yàn),P0.05,差異有顯著性意義；而CNE1細(xì)胞點(diǎn)突變前后無明顯改變。這些結(jié)果表明LMP1可以通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子EGFR和STAT3結(jié)合至cyclinD1啟動(dòng)子區(qū)的其結(jié)合位點(diǎn)共序列,并通過該位點(diǎn)協(xié)同反式激活cyclinD1啟動(dòng)子的活性。 綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)了在LMP1陽性表達(dá)的鼻咽癌細(xì)胞核存在轉(zhuǎn)錄因子EGFR和STAT3的核移位和共定位,及LMP1可誘導(dǎo)EGFR/STAT3相互呈復(fù)合物結(jié)合并且其結(jié)合的主要部位為胞核；LMP1調(diào)控EGFR和STAT3作用的主要靶基因是cyclin D1;LMP1既可以通過調(diào)控EGFR、STAT3結(jié)合于cyclin D1啟動(dòng)子區(qū)各自的結(jié)合位點(diǎn)調(diào)節(jié)cyclin D1啟動(dòng)子活性,又可通過調(diào)控EGFR、STAT3結(jié)合于cyclin D1啟動(dòng)子區(qū)EGFR/STAT3共結(jié)合序列而激活cyclin D1啟動(dòng)子。 本項(xiàng)目首次觀察到LMP1可調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子EGFR和STAT3共定位于鼻咽癌細(xì)胞核,為LMP1激活的轉(zhuǎn)錄因子EGFR和STAT3兩條不同的信號(hào)通路的整合提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的依據(jù)；也同樣首次發(fā)現(xiàn)鼻咽癌細(xì)胞cyclin D1啟動(dòng)子區(qū)存在EGFR/STAT3共結(jié)合位點(diǎn)序列,LMP1可調(diào)控EGFR/STAT3與該共結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合能力,并通過EGFR/STAT3與其結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合而激活cyclin D1啟動(dòng)子。這一新發(fā)現(xiàn)從蛋白質(zhì)間相互作用的新視野闡明了EGFR和STAT3參與細(xì)胞周期異常演進(jìn)的新機(jī)制,對(duì)EBV重要瘤蛋白LMP1的功能進(jìn)行了拓展,也為鼻咽癌分子靶向治療研發(fā)新的靶點(diǎn)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
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【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R739.6

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2233043