【摘要】： 鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是一種具有地域特異性的惡性腫瘤,在中國南部居惡性腫瘤發(fā)病率的第三位,與EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)感染密切相關。LMP1是EBV編碼的瘤蛋白,其生物學功能涉及細胞轉化、凋亡、分化、細胞周期行進以及參與惡性腫瘤的侵襲和轉移。以鼻咽癌為切入點,我們多年的研究工作一直致力于LMP1介導的信號轉導通路的研究,系統(tǒng)地研究了LMP1介導的信號轉導通路異常以及由此產生的一系列生物學效應。 轉錄因子是參與調節(jié)靶基因轉錄的的反式作用因子,能直接或間接識別或結合在各順式作用元件核心序列上,參與調控轉錄效率。轉錄因子是上游信號傳導事件與下游功能基因表達改變的聯(lián)系紐帶,也是信號傳導研究的重要核心。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)是一個170kDa的跨膜糖蛋白,屬于受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases, RTKs)家族成員。傳統(tǒng)的受體學說認為,細胞膜受體作為第一信使,在細胞膜上與其配體結合發(fā)揮其生物學效應,但細胞膜受體不能進入核內而不能直接影響基因轉錄。但近年來,在許多腫瘤如皮膚癌、乳腺癌、宮頸癌、膀胱癌、卵巢癌等的細胞核內發(fā)現高水平的EGFR表達,其作為一種新型轉錄因子在核內獨立或作為轉錄共活化子與其他轉錄因子相互作用于與細胞周期行進或細胞增殖密切相關的靶基因,促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。轉錄因子STAT3 (signal transducer and activation of transcription3, STAT3)是多種細胞因子和生長因子發(fā)揮作用的關鍵信號分子,其通過酪氨酸磷酸化的STAT之間形成同源二聚體或異源二聚體而活化,活化后移位至細胞核,激活多種相關下游靶基因的表達。STAT3蛋白能識別靶基因啟動子區(qū)的保守序列成分并通過該序列激活靶基因轉錄。 本室的前期研究首先發(fā)現在鼻咽癌細胞中LMP1通過其CTAR1 (carboxyterminal activating region 1,CTAR1)募集腫瘤壞死因子受體相關因子(Tumor Necrosis Factor Receptor Associated Factors, TRAFs)精細調控EGFR表達和上調EGFR磷酸化水平,進而促進細胞增殖,繼首次發(fā)現LMP1可以調控EGFR核移位,并呈EGF配體非依賴性。據報道用EGF刺激細胞后應用激光共聚焦檢查觀察,10分鐘即可細胞核內發(fā)現核EGFR的存在。同時,不少作者認為EGFR需與其他能直接結合于靶基因DNA的轉錄因子相互作用方能發(fā)揮促進細胞增殖的生物學作用。本室前期研究還發(fā)現在鼻咽癌細胞中存在LMP1激活的JAK/STAT信號通路,并且LMP1激活STAT途徑的結構基礎在于其CTAR2和CTAR3的協(xié)同作用。進一步發(fā)現LMP1通過JAK3促進STAT3酪氨酸705位磷酸化,磷酸化活化后的STAT3即核移位并核內積聚,并且LMP1調控磷酸化STAT3核移位呈705位酪氨酸磷酸化依賴性。我們推測LMP1有可能通過誘導轉錄因子EGFR和STAT3核移位調節(jié)其相互作用。為觀察在LMP1調控下轉錄因子EGFR和STAT3在鼻咽癌細胞核內是否存在共定位,選擇激光共聚焦掃描顯微鏡進行檢測,以LMP1陰性表達的鼻咽癌細胞CNE1細胞為陰性對照,發(fā)現在LMP1陽性表達的鼻咽癌細胞CNE1-LMP1細胞內存在EGFR和STAT3蛋白的共定位；應用免疫共沉淀[Co-immunoprecipitation (CO-IP)-western blot(WB)]方法檢測,顯示LMP1可調控鼻咽癌細胞內轉錄因子EGFR和STAT3呈復合物結合；再分別用胞漿和核蛋白做免疫共沉淀及western-blot檢測表明EGFR和STAT3復合物結合的主要亞細胞定位是細胞核。以上結果為LMP1調控轉錄因子EGFR和STAT3在鼻咽癌細胞核內的作用機制提供了重要的實驗基礎。 腫瘤作為一類細胞周期病,G1/S檢測點常在癌變多階段,甚至在癌前階段就已失調。細胞周期調節(jié)系統(tǒng)是腫瘤發(fā)生過程中常發(fā)生改變的調節(jié)網絡,尤其是cyclin D,作為一種調節(jié)G1/S期行進的重要正性調節(jié)蛋白,是連接外界生長因子、信號轉導與細胞周期調控機制的紐帶,常成為腫瘤發(fā)生過程中的分子靶。Cyclin D1是腫瘤細胞的細胞周期中G1期向S期行進必不可少的蛋白質之一,cyclin D1基因已被證實是重要瘤基因,cyclinD1的主要功能是促進細胞的增殖,而其基因轉錄受多種因素的調節(jié)。本室的前期研究發(fā)現LMP1可以活化cyclinD1的表達,EGFR可直接結合于細胞周期G1/S期調節(jié)分子cyclinD1和cyclin E啟動子區(qū),并反式激活cyclinD1和cyclin E啟動子活性,文獻證實STAT3可以通過與cyclin D1啟動子區(qū)結合位點結合并調節(jié)其轉錄功能。 為探討LMP1調控轉錄因子EGFR/STAT3作用的靶基因是否是cyclin D1基因,以LMP1表達陰性的鼻咽癌細胞CNE1和LMP1陽性表達的CNE1-LMP1細胞為模型,采用脂質體瞬時轉染方法將cyclin D1報道基因質粒轉染至CNE1、CNE1-LMP1細胞系后,進行熒光素酶報告基因分析。同時利用特異性靶向LMP1的脫氧核酶DZ1阻斷LMP1的表達后,進行報告基因分析,發(fā)現CNE1-LMP1細胞的cyclin D啟動子活性明顯高于CNE1,轉染了特異性靶向LMP1的脫氧核酶DZ1的CNE1-LMP1細胞系的報告基因活性顯著低于未經DZ1轉染的細胞。結果提示了LMP1能夠有效地分別調節(jié)轉錄因子EGFR和STAT3反式激活cyclinD1的活性。進一步通過小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)沉寂靶基因RNA策略,將EGFRsiRNA,STAT3siRNA分別和共同與cyclinD1報道質粒及轉染試劑轉染CNE1-LMP1細胞后,進行報告基因檢測,并與加入非特異性siRNA的對照組比較,發(fā)現前組各自的cyclinD1報道基因活性都明顯降低,T'檢驗,P值0.05,差異有顯著性意義；共轉染EGFRsiRNA和STAT3siRNA組的cyclinD1報道基因活性比各單獨轉染組更降低。提示不論獨立或同時沉寂cyclinD1啟動子區(qū)EGFR和STAT3mRNA均可降低LMP1調控的cyclinD1啟動子活性,從另一方面證明LMP1通過轉錄因子EGFR和STAT3調節(jié)cyclin D1啟動子活性。為探討LMP1是否可經調控轉錄因子EGFR/STAT3而調節(jié)cyclin D1 mRNA的轉錄水平,通過GeneBank和Primer3引物設計軟件搜索和設計合成人Cyclin D1的cDNA引物序列進行了real-time PCR檢測,經分別轉染EGFRsiRNA和STAT3siRNA與非特異性對照siRNA于CNE1-LMP1細胞,提取其mRNA進行real-time PCR實驗,顯示LMP1可通過轉錄因子EGFR. STAT3對CyclinD1 mRNA表達水平進行不同程度的調節(jié)；但是同時沉寂EGFR、STAT3轉錄因子并未顯示其抑制作用強于兩轉錄因子的分別沉寂的抑制作用,表現了CyclinD1 mRNA表達調控的復雜性。 文獻報道大量的細胞膜受體可以核移位,如EGFR, HER-2, FGFR(Fibroblast growth factor receptor, FGFR), HER-3。膜受體核移位后如何作用于靶基因的分子機制至今尚未完全明了。據報道EGFR核移位后能識別并結合至cyclinDl啟動子區(qū)富含AT的保守序列(AT-rich consensus sequence, ATRS)并反式激活cyclinDl基因的表達,但并未研究清楚EGFR是否能直接結合于cyclinD1啟動子ATRS;另有作者認為EGFR缺乏DNA結合域,需與其他能直接結合于DNA的轉錄因子相互作用方能發(fā)揮促進細胞增殖的生物學作用。激活后的STAT3即可核移位,通過識別靶基因上STAT3特異性的DNA結合成分而與其結合,并激活靶基因的轉錄。有作者發(fā)現STAT3蛋白的轉錄活性需要募集共活化子共同作用,如需與EGFR共同靶向iNOS啟動子才能最大程度地促進iNOS基因表達。鼻咽癌細胞cyclin D1啟動子區(qū)是否存在EGFR與STAT3共結合DNA序列,LMP1通過轉錄因子EGFR和STAT3調控cyclin D1轉錄的作用機制是通過對cyclinD1啟動子區(qū)EGFR、STAT3各自獨立結合位點或EGFR/STAT3共結合位點而發(fā)揮生物調控作用?首先分析LMP1通過誘導EGFR、STAT3分別與cyclinD1基因啟動子區(qū)各自的結合位點結合并反式激活作用,通過電泳遷移率變動分析(electrophoretic mobility shift assay, EMSA),并且基于已證實的某些小分子抑制劑可阻斷LMP1誘導EGFR/STAT3的主要磷酸化位點激活,而抑制其核移位的實驗基礎,采用小分子阻斷策略觀察抑制EGFR/STAT3核移位后對其與CyclinD1啟動子區(qū)結合能力的影響。結果顯示LMP1陽性細胞核蛋白與生物素標記野生型EGFR形成的結合帶明顯強于LMP1陰性表達細胞,提示LMP1能夠調控EGFR與CyclinD1啟動子區(qū)EGFR結合位點DNA的結合。利用酪氨酸激酶小分子抑制劑AG1478阻斷EGFR磷酸化途徑后,其與CyclinD1啟動子區(qū)DNA結合能力降低,表明酪氨酸激酶抑制劑AG1478能夠降低LMP1調控的EGFR與CyclinD1啟動子區(qū)DNA結合的能力,這從另一方面證實LMP1可調控EGFR與CyclinD1啟動子區(qū)結合。同時發(fā)現LMP1能夠調控STAT3與CyclinD1啟動子區(qū)STAT3結合位點的結合能力,利用小分子阻斷劑WHI-p131, PD98059,阻斷STAT3磷酸化后,可以降低STAT3與CyclinD1啟動子DNA結合能力,證實LMP1可調控STAT3與CyclinD1啟動子區(qū)的結合能力。進一步通過報告基因檢測發(fā)現LMP1通過EGFR和STAT3誘導上調的cylinD1啟動子活性能被EGFRTry1173位磷酸化,STAT3酪氨酸705位磷酸化和STAT3絲氨酸727位磷酸化的小分子阻斷劑分別不同程度地抑制。這些結果從正反兩方面證明了LMP1可通過調控轉錄因子EGFR和STAT3結合于cyclinD1啟動子區(qū)各自的結合位點而調節(jié)cyclin D1啟動子活性的作用機制。 根據分子生物學信息技術及參考文獻,我們推測在cyclin D1啟動子區(qū)存在EGFR和STAT3共結合(consensus)潛在的位點,分析其序列為TTCTATGAA.經分析在CYCLIND1啟動子區(qū)只有一個EGFR和STAT3潛在的共結合位點TTCTATGAA。根據該序列設計PCR引物,采用CHIP(Chromatin immunoprecipitation, CHIP、PCR及瓊脂糖凝膠電泳分析,顯示CNE1-LMP1活體細胞內Cyclin D1啟動子區(qū)存在EGFR、STAT3結合的共結合序列；不能忽略的是CNE1細胞內CyclinD1啟動子區(qū)也存在與EGFR、STAT3結合的共序列,這個共序列的存在也可能是鼻咽癌細胞的共同生物結構特征；通過設計并合成包含EGFR/STAT3共結合序列的生物素標記探針,采用EMSA分析發(fā)現CNE1-LMP1細胞核蛋白與生物素標記野生型探針結合能力顯著高于CNE1細胞,提示LMP1可以調控轉錄因子STAT3和EGFR與cyclinD1基因啟動子區(qū)結合位點共序列的結合能力。運用點突變原則將cyclin D1啟動子報道基因質粒推測的EGFR和STAT3共序列的部分關鍵核苷酸進行點突變,使轉錄因子EGFR和STAT3不能與cyclinD 1啟動子區(qū)的共結合序列結合,從而不能反式激活cyclinD1,再轉染CNE1和CNE1-LMP1細胞進行報告基因檢測,結果發(fā)現點突變后LMP1細胞cylin D1啟動子轉錄活性明顯降低,約1倍,t'檢驗,P0.05,差異有顯著性意義；而CNE1細胞點突變前后無明顯改變。這些結果表明LMP1可以通過調控轉錄因子EGFR和STAT3結合至cyclinD1啟動子區(qū)的其結合位點共序列,并通過該位點協(xié)同反式激活cyclinD1啟動子的活性。 綜上所述,本研究發(fā)現了在LMP1陽性表達的鼻咽癌細胞核存在轉錄因子EGFR和STAT3的核移位和共定位,及LMP1可誘導EGFR/STAT3相互呈復合物結合并且其結合的主要部位為胞核；LMP1調控EGFR和STAT3作用的主要靶基因是cyclin D1;LMP1既可以通過調控EGFR、STAT3結合于cyclin D1啟動子區(qū)各自的結合位點調節(jié)cyclin D1啟動子活性,又可通過調控EGFR、STAT3結合于cyclin D1啟動子區(qū)EGFR/STAT3共結合序列而激活cyclin D1啟動子。 本項目首次觀察到LMP1可調控轉錄因子EGFR和STAT3共定位于鼻咽癌細胞核,為LMP1激活的轉錄因子EGFR和STAT3兩條不同的信號通路的整合提供了結構基礎的依據；也同樣首次發(fā)現鼻咽癌細胞cyclin D1啟動子區(qū)存在EGFR/STAT3共結合位點序列,LMP1可調控EGFR/STAT3與該共結合位點的結合能力,并通過EGFR/STAT3與其結合位點的結合而激活cyclin D1啟動子。這一新發(fā)現從蛋白質間相互作用的新視野闡明了EGFR和STAT3參與細胞周期異常演進的新機制,對EBV重要瘤蛋白LMP1的功能進行了拓展,也為鼻咽癌分子靶向治療研發(fā)新的靶點提供了實驗依據。
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【學位授予單位】：中南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R739.6

【參考文獻】

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本文編號：2233043