【摘要】： 眾所周知,在成年哺乳動物,與周圍神經(jīng)系統(tǒng)相比,中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損后再生和功能恢復(fù)比較困難。已有研究發(fā)現(xiàn),雖然中樞神經(jīng)元軸突本身具有類似的再生潛能,但受損神經(jīng)元所處的微環(huán)境可能是決定其再生失敗的重要原因。 中樞神經(jīng)損傷后,在損傷區(qū)形成由變性髓鞘碎片、壞死細(xì)胞、沉積纖維蛋白和膠原纖維等成份組成的致密的膠質(zhì)瘢痕,使大多數(shù)發(fā)芽的軸突不能越過此膠質(zhì)瘢痕而停止生長。為了促進(jìn)新生軸突能夠穿越這些膠質(zhì)瘢痕到達(dá)失神經(jīng)支配的靶器官,大量的蛋白酶參與了此過程。 纖溶酶原激活劑(Plasminogen activators,PAs)是一種絲氨酸蛋白酶,在體內(nèi)主要是通過激活纖溶酶原(Plasminogen,Plg)轉(zhuǎn)變?yōu)槔w溶酶(plasmin,Pln),后者是一種廣譜的蛋白水解酶,能夠降解細(xì)胞外的細(xì)胞受體、生長因子及細(xì)胞外基質(zhì)組分。金屬基質(zhì)蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)是一組鋅依賴的蛋白水解酶,由正常組織細(xì)胞和炎癥及腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生,以無活性的酶原形式分泌,參與細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)的降解及ECM不同組成成分的重塑,參與神經(jīng)系統(tǒng)的病變調(diào)控和組織修復(fù)過程。 本課題以屬于中樞神經(jīng)的小鼠視神經(jīng)為研究對象,通過建立成年小鼠視神經(jīng)夾傷模型,用形態(tài)學(xué)和生物學(xué)方法研究小鼠視神經(jīng)損傷后及其再生過程中,神經(jīng)夾傷部位破損血管中溢出的血源性因子,主要包括：免疫球蛋白(immunoglobulinG,Ig G)、纖維蛋白(原)(fibrin(ogen))、纖溶酶原激活物(plasminogen activators,PAs)及金屬基質(zhì)蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)的表達(dá)變化情況,以了解ECM各蛋白酶在視神經(jīng)損傷后的變化,分析ECM蛋白酶活性的變化與小鼠視神經(jīng)損傷及再生之間的關(guān)系,為更深一步揭示炎癥性損傷的中樞神經(jīng)的再生修復(fù)微環(huán)境所起作用奠定基礎(chǔ)。 材料與方法 健康成年雄性C57 BL／6J小鼠,腹腔注射麻醉后,行外眥切開術(shù),暴露視神經(jīng),在距視神經(jīng)球后起始部約2mm處,用顯微鉗鉗夾視神經(jīng)45s；縫合皮膚切口。左眼作為自身對照,僅暴露視神經(jīng),不作鉗夾處理。 模型鼠構(gòu)建完成后,于術(shù)后1h、2h、4h、8h、16h、1d、2d、7d和28d分別進(jìn)行心臟灌注沖洗血液,取材做組織切片及提取視神經(jīng)蛋白,采取HE染色測定在小鼠視神經(jīng)夾傷后視神經(jīng)的變性,用Western blot方法檢測損傷后不同時(shí)間點(diǎn)視神經(jīng)組織內(nèi)神經(jīng)絲(Neurofilament,NF)、MMP-9、fibrin(ogen)、IgG的表達(dá)量變化情況,同時(shí)采用原位酶譜分析法檢測plasminogen activators(PAs)活性在視神經(jīng)損傷后各階段的變化。 結(jié)果 HE染色結(jié)果顯示,隨著小鼠視神經(jīng)夾傷后的時(shí)間延長,視神經(jīng)潰變逐漸加重,視神經(jīng)纖維走行迂曲、排列不規(guī)則,膠質(zhì)細(xì)胞核增多、排列紊亂,可見細(xì)胞呈空泡樣變性。 Western blot方法結(jié)果顯示,正常視神經(jīng)組織內(nèi)NF蛋白表達(dá)水平較高,在損傷早期,視神經(jīng)組織中NF維持較高的水平(接近于對照),直至損傷后第7d,NF的表達(dá)呈現(xiàn)出明顯的下降,至損傷后28天視神經(jīng)組織內(nèi)僅能檢測到少量NF。在正常視神經(jīng)組織內(nèi),只有微量的IgG表達(dá),而損傷側(cè)的視神經(jīng)組織內(nèi)IgG表達(dá)水平明顯增加,損傷后28d仍能檢測出大量的表達(dá)；只有微量的纖維蛋白沉積在對照側(cè)正常神經(jīng)組織內(nèi),而損傷側(cè)神經(jīng)組織在損傷后l小時(shí)就能檢測出纖維蛋白的溢出,至損傷后第7d纖維蛋白沉積基本被清除。在對照側(cè)神經(jīng)組織內(nèi),只有微量的MMP9表達(dá),損傷后的視神經(jīng)MMP-9的蛋白水平有少許增加,在損傷后2d達(dá)到高峰,以后仍有高水平的表達(dá),但MMP-9是以活性較低的前體形式存在的,分子量92 KDa。 原位酶譜法結(jié)果顯示,視神經(jīng)損傷后1d視神經(jīng)周圍即可見邊界清晰的黑色溶解帶,至損傷后第7d溶解帶范圍最大,而反應(yīng)體系中給予特異性的尿激酶型纖溶酶原激活劑(Urokinase Plasminogen Activator,uPA)酶活性抑制劑阿米洛利將uPA酶活性抑制后,發(fā)現(xiàn)黑色溶解帶幾乎消失。表明PA活性在視神經(jīng)損傷后即出現(xiàn)增高,在損傷后第7天達(dá)到高峰,一直持續(xù)到第28天時(shí)仍有很高的活性,且起作用的PA主要是uPA。 結(jié)論 小鼠視神經(jīng)夾傷動物模型的成功建立,為研究微環(huán)境在中樞神經(jīng)損傷及再生中的作用提供了有用的工具。沉積于損傷部位的fibrin(ogen)清除情況與IgG不同,不依賴于BNB的徹底修復(fù),表明CNS的損傷,能夠引發(fā)較為迅速強(qiáng)烈的PA／P1g／Pln級聯(lián)的快速激活。MMP-9以無活性的前體形式蓄積,一旦被激活,受損的神經(jīng)極有可能面臨更加嚴(yán)峻的微環(huán)境。uPA可以清除視神經(jīng)損傷部位沉積的fibrin(ogen),修復(fù)該異常蓄積引發(fā)的不利于神經(jīng)再生的蛋白水解微環(huán)境,還能通過Plg／Pln級聯(lián)改變損傷部位的細(xì)胞外基質(zhì)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R774.6

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 周國民;;視網(wǎng)膜及視神經(jīng)—腦結(jié)構(gòu)與功能研究的窗口[J];解剖學(xué)雜志;2006年01期

2 王一,周繼紅,許立軍,馬志中,劉杰;間接視神經(jīng)損傷動物模型的研制[J];中華創(chuàng)傷雜志;1999年04期

，

本文編號：2224199