【摘要】：目的轉(zhuǎn)錄因子Mathl誘導(dǎo)了終末支持細(xì)胞向新生毛細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化.1)本實(shí)驗(yàn)在描述支持細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為新生毛細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化過程的同時(shí),通過使用正常毛細(xì)胞相關(guān)特異性標(biāo)記物,在形態(tài)學(xué)方面對新生毛細(xì)胞和正常毛細(xì)胞進(jìn)行了比較；2)本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步闡述了在Mathl的作用下支持細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為毛細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化機(jī)制；3)本實(shí)驗(yàn)在功能學(xué)方面對新生毛細(xì)胞與發(fā)育中的正常毛細(xì)胞進(jìn)行了比較,探討其是否已經(jīng)具備了正常毛細(xì)胞的功能性。 方法本實(shí)驗(yàn)使用了正常出生后3天的新生SD大鼠耳蝸進(jìn)行體外器官培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)組在培養(yǎng)的過程中通過腺病毒轉(zhuǎn)染了Math1(作用基因)和EGFP(報(bào)告基因)兩個基因(Ad5-EGFP-Mathl),對照組則只轉(zhuǎn)染了EGFP(Ad5-EGFP).首先,在轉(zhuǎn)染基因后不同的時(shí)間點(diǎn)對培養(yǎng)組織進(jìn)行固定,通過免疫熒光染色技術(shù)標(biāo)記毛細(xì)胞相關(guān)特異性蛋白來鑒定是否有新生毛細(xì)胞的產(chǎn)生,并描述了轉(zhuǎn)分化的過程；其次,在耳蝸器官培養(yǎng)過程中,通過采用了Brdu摻入法,探討了支持細(xì)胞向新生毛細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化機(jī)制；然后,通過檢測新生毛細(xì)胞是否有攝取耳毒性藥物新霉素, FM1-43的能力,來驗(yàn)證是否存在毛細(xì)胞特征性的機(jī)械性門控通道；最后,我們采用Patch Clamp技術(shù),在不同的時(shí)間點(diǎn)對新生毛細(xì)胞的各種通道電流,動作電位以及特征性的機(jī)械門控通道電流等在不同時(shí)間變化以及相關(guān)的動力學(xué)分析,驗(yàn)證Math1誘導(dǎo)的新生毛細(xì)胞是否已經(jīng)具備了正常毛細(xì)胞的功能。 結(jié)果①實(shí)驗(yàn)組在Ad5-EGFP-Mathl轉(zhuǎn)染耳蝸組織后的第三天,開始在小上皮嵴區(qū)域出現(xiàn)了MyosinVIIA陽性細(xì)胞,大上皮嵴區(qū)域則在轉(zhuǎn)染五天后出現(xiàn)MyosinVIIA陽性細(xì)胞；鈣緩沖蛋白,如Calbindin,Calmodulin,Calretinin和PMCA2作為毛細(xì)胞的相關(guān)特異性標(biāo)記物,也能在異位新生毛細(xì)胞上表達(dá)；Phlloidin的染色展示了新生毛細(xì)胞頂部的簇狀靜纖毛樣結(jié)構(gòu)；在對照組的耳蝸的大、小上皮嵴區(qū)域則未出現(xiàn)這些現(xiàn)象；②Brdu摻入實(shí)驗(yàn)表明,支持細(xì)胞向新生毛細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化過程為直接轉(zhuǎn)分化,不依賴于支持細(xì)胞的增殖；另外,Math1的表達(dá)水平是誘導(dǎo)毛細(xì)胞分化的關(guān)鍵因素；③1mM的耳毒性藥物新霉素能夠引起異位新生毛細(xì)胞的死亡；從Math1轉(zhuǎn)染后5天,部分新生毛細(xì)胞開始有能力對FM1-43的攝取,間接說明毛細(xì)胞能通過機(jī)械門控通道攝取耳毒性藥物及FM1-43；④Mathl轉(zhuǎn)染后的2天,新生毛細(xì)胞開始表達(dá)鈉電流,到第5天電流密度達(dá)最大,然后逐漸減��；對照組的支持細(xì)胞不表達(dá)鈉電流；⑤Mathl轉(zhuǎn)染后三天,新生毛細(xì)胞開始表達(dá)鈣電流,電流密度隨著時(shí)間逐漸增大；對照組支持細(xì)胞不表達(dá)鈣電流；⑥Mathl轉(zhuǎn)染后五天,新生毛細(xì)胞表達(dá)為快速失活的延遲性鉀整流,然后,表現(xiàn)為持續(xù)性基本不失活的延遲性鉀整流,且電流密度逐漸增大；而對照組的支持細(xì)胞僅表達(dá)持續(xù)不失活的幅度很小的延遲性鉀整流；⑦M(jìn)athl轉(zhuǎn)染后五天,新生毛細(xì)胞表達(dá)了典型的HCN電流,且隨著時(shí)間電流密度逐漸減小,然后消失；⑧大多數(shù)的新生毛細(xì)胞上能記錄到誘發(fā)的動作電位,極少數(shù)的能記錄到自發(fā)的動作電位：⑨Mathl轉(zhuǎn)染后7天,我們記錄到了新生毛細(xì)胞的機(jī)械門控通道電流。 結(jié)論①利用了腺病毒轉(zhuǎn)基因方式成功的建立了新生大鼠耳蝸體外培養(yǎng)在Mathl誘導(dǎo)下產(chǎn)生異位新生毛細(xì)胞的模型；②新生毛細(xì)胞已經(jīng)具備正常毛細(xì)胞樣的形態(tài),并且表達(dá)許多相同的特異性相關(guān)蛋白；③支持細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為毛細(xì)胞的機(jī)制為直接轉(zhuǎn)分化,無需增殖后再轉(zhuǎn)分化；④新生毛細(xì)胞有能力攝取耳毒性藥物新霉素,FMl-43,間接表明機(jī)械門控通道在新生毛細(xì)胞纖毛上的存在；⑤機(jī)械門控通道電流的出現(xiàn),在功能上標(biāo)志了再生的毛細(xì)胞已經(jīng)具備了毛細(xì)胞的特性；⑥各種通道電流,動作電位在新生毛細(xì)胞上的有序出現(xiàn),模擬了發(fā)育中的正常毛細(xì)胞的各種離子通道電流有序出現(xiàn)的過程,證實(shí)了Mathl誘導(dǎo)的新生毛細(xì)胞是未成熟的、正在發(fā)育中的,具有功能的毛細(xì)胞。
[Abstract]:Objective Transcription factor Mathl induces the transformation of Sertoli cells into new hair cells. 1) In this study, the morphological changes of Sertoli cells into new hair cells were described and compared with those of normal hair cells by using specific markers related to normal hair cells. (3) We compared the function of new hair cells with that of normal hair cells in order to find out whether they have the function of normal hair cells.
Methods The cochlear organs of neonatal SD rats were cultured in vitro at 3 days after birth. The experimental group was transfected with Ad5-EGFP-Mathl and EGFP-Mathl by adenovirus. The control group was transfected with EGFP only. Immunofluorescence staining was used to identify whether there were new hair cells and to describe the process of transdifferentiation. Secondly, Brdu incorporation was used to explore the mechanism of the transformation of Sertoli cells into new hair cells. Then, we tested the ability of newborn hair cells to absorb the ototoxic drug neomycin, FM1-43, to verify the existence of the characteristic mechanical gated channels; finally, we used Patch Clamp technology, at different time points on the newborn hair cells of various channel currents, action potential and the characteristic mechanical gated pass. The changes of channel current at different time and related kinetic analysis verify that the new hair cells induced by Math1 have the function of normal hair cells.
Results (1) On the third day after cochlear tissue was transfected with Ad5-EGFP-Mathl, Myosin VIIA positive cells began to appear in the small epithelial ridge area, Myosin VIIA positive cells appeared in the large epithelial ridge area after transfection, and calcium buffering proteins such as Calbindin, Calmodulin, Calretinin and PMCA2 were used as specific markers of hair cells. Phlloidin staining showed a cluster of stationary cilia-like structures on the top of the newly formed hair cells; these phenomena did not occur in the large and small epithelial ridge areas of the control cochlea; (2) Brdu incorporation experiment showed that the transformation of the supporting cells into the new hair cells was direct, independent of the differentiation process. In addition, the expression level of Math1 was the key factor to induce hair cell differentiation; 3. 1 mM ototoxic drug neomycin could cause the death of ectopic hair cells; 5 days after Math1 transfection, some of the new hair cells began to have the ability to uptake FM1-43, which indirectly indicated that hair cells could be uptaken through a mechanical gated channel. Two days after Mathl transfection, the sodium current was expressed in the new hair cells, and the current density reached the maximum on the fifth day, then decreased gradually; the supporting cells in the control group did not express sodium current; _Three days after Mathl transfection, the calcium current began to express in the new hair cells, and the current density increased gradually with time in the control group; The Sertoli cells did not express calcium currents; _Five days after Mathl transfection, the new hair cells expressed delayed potassium rectifier which was rapidly inactivated, and then showed delayed potassium rectifier which was basically inactivated, and the current density increased gradually; while the control group only expressed delayed potassium rectifier which was not inactivated continuously. _Five days after Mathl transfection, HCN currents were expressed in the new hair cells, and the current density gradually decreased with time, then disappeared; _Most of the new hair cells could record evoked action potential, a few of them could record spontaneous action potential: _7 days after Mathl transfection, we recorded the mechanism of the new hair cells. Mechanical gated channel current.
Conclusion The model of ectopic hair cells in neonatal rat cochlea induced by Mattel was successfully established by adenovirus transgene. The new hair cells had normal hair cell-like morphology and expressed many identical specific related proteins. The mechanism of supporting cells transdifferentiation into hair cells was discussed. (4) Newborn hair cells have the ability to absorb the ototoxic drug neomycin, FMl-43, which indirectly indicates the existence of mechanical-gated channels on the cilia of newborn hair cells; (6) The appearance of mechanical-gated channel current indicates that the regenerated hair cells have the characteristics of hair cells. _The orderly appearance of various channel currents and action potentials on the new hair cells simulated the orderly appearance of various ion channel currents in the developing normal hair cells, and confirmed that the new hair cells induced by Mathl were immature, developing and functional hair cells.
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R764

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本文編號：2184907