【摘要】： 研究背景： 慢性創(chuàng)面是外科常見(jiàn)疾病,病因繁多、病理復(fù)雜,組織再生能力差,愈合困難。在改善全身狀態(tài),控制原發(fā)病的基礎(chǔ)上,目前慢性創(chuàng)面的治療方式除了手術(shù)清除壞死組織外,主要是依靠外用藥物或敷料進(jìn)行的。缺血是慢性創(chuàng)面發(fā)生形成的一個(gè)重要原因,因此刺激血管新生,改善血運(yùn),增強(qiáng)組織再生能力,促進(jìn)傷口愈合,成為慢性創(chuàng)面修復(fù)的一個(gè)研究重點(diǎn)。最近引人注目的是生物活性生長(zhǎng)因子如TGFbeta、bFGF以及神經(jīng)傳遞因子CGRP(calcintonin-gene related peptide)和asoactive intestinal polypeptide的應(yīng)用。bFGF作為重要的血管生成刺激因子和目前已知最強(qiáng)的促有絲分裂素,不僅可以促使多種細(xì)胞分裂增生、趨化,促進(jìn)血管新生,而且在組織修復(fù)、創(chuàng)面愈合過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。將bFGF蛋白因子直接作用于創(chuàng)面,其治療作用有限,且易被創(chuàng)面內(nèi)各種酶降解；持續(xù)性的直接給藥,成本太高。而通過(guò)載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)然方法將bFGF蛋白因子應(yīng)用于創(chuàng)面發(fā)揮作用,能持續(xù)改善血運(yùn)、增強(qiáng)組織再生能力,促進(jìn)傷口愈合,現(xiàn)已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。但目前生長(zhǎng)因子的基因治療策略,都存在轉(zhuǎn)然效率低下、載體靶向特異性差,基因表達(dá)時(shí)間短等缺點(diǎn),影響了其療效。因此,本研究旨在,設(shè)計(jì)構(gòu)建新型嵌合型重組腺病毒,提高其轉(zhuǎn)染效率、改善靶向性,增強(qiáng)bFGF的基因表達(dá),并將嵌合型重組腺病毒用以介導(dǎo)bFGF作用于兔耳慢性缺血性創(chuàng)面。 研究目的： 應(yīng)用兔耳缺血慢性創(chuàng)面模型,用經(jīng)改造的具有高效感染能力和靶向表達(dá)能力的腺病毒載體,介導(dǎo)人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)的表達(dá),研究其是否可以促進(jìn)血管新生,增強(qiáng)組織細(xì)胞再生,促進(jìn)慢性創(chuàng)面愈合,對(duì)慢性創(chuàng)面是否具有保護(hù)作用。并分別比較評(píng)價(jià)其和傳統(tǒng)腺病毒介導(dǎo)的bFGF、外源性bFGF對(duì)創(chuàng)面愈合的效果差異及影響。 研究?jī)?nèi)容和方法： 1.構(gòu)建、鑒定和擴(kuò)增重組嵌合型腺病毒Ad5F35-ET-bFGF。通過(guò)PCR的方法擴(kuò)增EDN1啟動(dòng)子將其插入前期構(gòu)建完成的pDC316-bFGF腺病毒穿梭載體得到pDC316ET-bFGF,將穿梭質(zhì)粒pDC316ET-bFGF與Ad5/F35嵌合型腺病毒骨架質(zhì)粒pPE3-F35共轉(zhuǎn)染至包裝細(xì)胞得到病毒空斑,經(jīng)PCR方法和基因測(cè)序鑒定得到正確的重組克隆即Ad5F35-ET-bFGF,然后經(jīng)過(guò)反復(fù)感染293細(xì)胞擴(kuò)增得到一定滴度的腺病毒,經(jīng)氯化銫密度梯度離心法純化病毒,最后通過(guò)計(jì)算TCID50換算出最終病毒滴度。 2.兔耳缺血慢性創(chuàng)面模型的建立和重組腺病毒在創(chuàng)面的表達(dá)。在新西蘭白兔兔耳背側(cè)制成直徑為1cm的一個(gè)圓形皮膚缺損區(qū),直至暴露軟骨。以肉眼大體觀察、HE染色、創(chuàng)面愈合率計(jì)算、兔耳皮溫測(cè)定、靜脈血?dú)夥治黾盁晒饷庖邫z測(cè)等評(píng)價(jià)該模型的可靠性和可行性及鑒定重組腺病毒在創(chuàng)面內(nèi)的表達(dá)情況。 3.嵌合型重組腺病毒介導(dǎo)的bFGF對(duì)兔耳慢性創(chuàng)面的基因治療。實(shí)驗(yàn)分為5組：Ad5F35-ET-bFGF組、Ad5bFGF組、Ad5F35-ET-EGFP組、外源性bFGF組和空白對(duì)照組。術(shù)后第1、3、5、7、9、14d,使用微量注射器多點(diǎn)(分10點(diǎn))于每只兔耳創(chuàng)面周緣皮下分別注射實(shí)驗(yàn)試劑：Ad5F35-ET-bFGF處理組每個(gè)創(chuàng)面注入108pfu/ml的重組嵌合型腺病毒Ad5F35-ET-bFGF,病毒用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋至總量lml,每點(diǎn)0.1ml；Ad5-bFGF處理組使用同樣方法注入10pfu/ml的Ad5-bFGF lml; Ad5F35-ET-EGFP組使用同樣方法注入108pfu/ml的Ad5-bFGF 1ml;外源性bFGF處理組使用同樣方法注入108pfu/ml的重組牛bFGF lml;空白對(duì)照組不予干預(yù)。通過(guò)大體觀察、HE染色和免疫組化、PCR、Western等方法檢測(cè)bFGF在創(chuàng)面中的表達(dá),評(píng)價(jià)構(gòu)建的重組嵌合型腺病毒介導(dǎo)的bFGF和傳統(tǒng)腺病毒介導(dǎo)的bFGF、外源性bFGF對(duì)創(chuàng)面愈合的不同效果及影響。 研究結(jié)果： 1.通過(guò)同源重組技術(shù),構(gòu)建制備了END1啟動(dòng)子引導(dǎo)的攜帶bFGF基因,具有高度感染和特異靶向表達(dá)能力的嵌合型增殖腺病毒Ad5F35-ET-bFGF,測(cè)定病毒滴度為5.56×1010pfu/ml。 2.制備了兔耳缺血慢性創(chuàng)面模型,通過(guò)大體觀察、HE染色、創(chuàng)面愈合率計(jì)算證實(shí)兔耳缺血?jiǎng)?chuàng)面模型可靠、穩(wěn)定、可行性高。熒光免疫方法說(shuō)明重組腺病毒成功轉(zhuǎn)染于創(chuàng)面組織,在細(xì)胞內(nèi)呈陽(yáng)性表達(dá),且表達(dá)時(shí)間至少持續(xù)2周。 3.HE染色、免疫組織化學(xué)說(shuō)明Ad5F35-ET-bFGF在慢性創(chuàng)面組織中持續(xù)性高表達(dá)；Wsetern Blot半定量檢測(cè)證明bFGF蛋白在創(chuàng)面組織內(nèi)過(guò)量表達(dá)至少持續(xù)2周。熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果證明轉(zhuǎn)染后創(chuàng)面內(nèi)bFGFmRNA水平明顯增加。所有結(jié)果均顯示Ad5F35-ET-bFGF對(duì)慢性創(chuàng)面的治療效果要優(yōu)于其它實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。 結(jié)論： 本課題的研究,建立了兔耳缺血慢性創(chuàng)面模型,在構(gòu)建具有高感染效率和特異靶向表達(dá)能力的嵌合型重組腺病毒Ad5F35-ET基礎(chǔ)上,介導(dǎo)bFGF基因治療缺血慢性創(chuàng)面。證實(shí)其對(duì)慢性創(chuàng)面具有良好的治療效果,優(yōu)于傳統(tǒng)腺病毒和外源性生長(zhǎng)因子。實(shí)驗(yàn)中改進(jìn)的一些研究方法,產(chǎn)生的特色和創(chuàng)新技術(shù),也代表了未來(lái)bFGF基因治療的發(fā)展方向。
[Abstract]:Research background:
Chronic wound is a common surgical disease. There are many causes, complicated pathology, poor tissue regeneration and difficult healing. On the basis of improving the state of the whole body and controlling the original disease, the treatment of chronic wounds is mainly based on the external use of drugs or dressings except the operation to remove the necrotic tissue. Ischemia is a chronic wound. It is important to stimulate angiogenesis, improve blood transport, enhance tissue regeneration, and promote wound healing. It has become a focus of research on chronic wound repair. Recently, it is noticeable that bioactive growth factors such as TGFbeta, bFGF and neurotransmitter CGRP (calcintonin-gene related peptide) and asoactive intestinal Polype The application of ptide, as an important angiogenic stimulator and the strongest known mitogen, can not only promote the proliferation, chemotaxis and angiogenesis of many cells, but also play an important role in tissue repair and wound healing. The effect of bFGF egg white factor on the wound is limited. It is easy to be degraded by various enzymes in the wound; the cost of continuous direct administration is too high. And the bFGF protein factor is applied to the wound by the vector mediated gene transfer method, which can improve the blood transport, enhance the ability of tissue regeneration and promote the healing of the wound. The therapeutic strategies have the disadvantages of low efficiency, poor target specificity and short gene expression time. Therefore, this study aims to design and construct a new chimeric recombinant adenovirus to improve the transfection efficiency, improve the targeting and enhance the gene expression of bFGF, and use the chimeric recombinant adenovirus to mediate bFGF Chronic ischemic wound in rabbit ears.
The purpose of the study is:
The expression of human basic fibroblast growth factor (bFGF) was mediated by the modified model of rabbit ear ischemia and chronic wound surface, and the expression of human basic fibroblast growth factor (bFGF) was mediated, and whether it could promote angiogenesis, enhance the regeneration of tissue cells, promote the healing of chronic wounds, and protect the chronic wounds. The effects of bFGF and traditional bFGF on wound healing were compared and compared.
Research contents and methods:
1. construction, identification and amplification of recombinant chimeric adenovirus Ad5F35-ET-bFGF., the EDN1 promoter was amplified by PCR to insert pDC316ET-bFGF into the early constructed pDC316-bFGF adenovirus shuttle vector, and the shuttle plasmid pDC316ET-bFGF and Ad5/F35 chimeric adenovirus matrix pPE3-F35 were co transfected to the packaged cell to obtain the virus. The correct recombinant clone, Ad5F35-ET-bFGF, was obtained by PCR method and gene sequencing. Then the adenovirus was amplified by repeated infection of 293 cells. The virus was purified by cesium density gradient centrifugation. Finally, the virus titer was converted to the final virus by calculating TCID50.
2. the model of rabbit ear ischemic chronic wound and the expression of recombinant adenovirus in the wound. A circular skin defect area with a diameter of 1cm was made in the ear dorsal side of New Zealand white rabbit. The gross observation, HE staining, wound healing rate, rabbit ear skin temperature measurement, venous blood gas analysis and fluorescence immunoassay were evaluated. The reliability and feasibility of the model and the expression of recombinant adenovirus in the wound were identified.
The gene therapy of 3. chimeric recombinant adenovirus mediated bFGF for rabbit ear chronic wound. The experiment was divided into 5 groups: group Ad5F35-ET-bFGF, group Ad5bFGF, group Ad5F35-ET-EGFP, exogenous bFGF group and blank control group. After operation, 1,3,5,7,9,14d, multipoint injector was used (10 points) to be injected subcutaneously on the periphery of each rabbit ear: Ad The recombinant chimeric adenovirus Ad5F35-ET-bFGF was injected into each wound of the 5F35-ET-bFGF treatment group, and the virus was diluted to the total amount of LML and 0.1ml with the phosphate buffer solution (PBS). The Ad5-bFGF treatment group used the same method to infuse 10pfu/ml Ad5-bFGF LML; Ad5F35-ET-EGFP group used the same method to inject 108pfu/ml. The F treatment group used the same method to infuse the recombinant bovine b FGF LML with the same method, and the blank control group did not intervene. Through gross observation, HE staining and immunohistochemistry, PCR, Western and other methods, the expression of bFGF in the wound was detected. The recombinant chimeric adenovirus mediated bFGF and common adenovirus mediated bFGF, and exogenous bFGF on the wound healing were evaluated. Different effects and effects.
The results of the study:
1. through the homologous recombination technology, the END1 promoter guided bFGF gene was constructed and the chimeric proliferating adenovirus Ad5F35-ET-bFGF with high infection and specific target expression was constructed, and the virus titer was measured to be 5.56 x 1010pfu/ml.
2. the model of rabbit ear ischemia and chronic wound was prepared. Through gross observation, HE staining, the calculation of wound healing rate confirmed that the rabbit ear ischemic wound model was reliable, stable and feasible. The fluorescent immunoassay showed that the recombinant adenovirus was transfected to the wound tissue successfully, and the expression was positive in the cell, and the expression time lasted for at least 2 weeks.
3.HE staining, immunohistochemistry showed that Ad5F35-ET-bFGF was highly expressed in the chronic wound tissue, and the Wsetern Blot semi quantitative detection showed that the excessive expression of bFGF protein in the wound tissue lasted for at least 2 weeks. The fluorescence quantitative PCR detection results showed that the bFGFmRNA level in the wound was obviously increased after the transfection. All the results showed Ad5F35-ET-bFGF. The therapeutic effect of chronic wounds is better than that of other experimental groups and control groups.
Conclusion:
On the basis of building a chimeric recombinant adenovirus Ad5F35-ET with high infection efficiency and specific target expression, bFGF gene is used to treat chronic ischemic wounds. It is proved that it has good therapeutic effect on chronic wound, which is better than traditional adenovirus and exogenous growth cause. Some of the improved research methods, characteristics and innovative technologies in the experiment also represent the future direction of bFGF gene therapy.
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R764

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本文編號(hào)：2123963